張佳俊， 廖鮮艷， 翁新楚

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444)

腫瘤疾病對(duì)人類健康的危害日趨嚴(yán)重，如何通過(guò)有效措施防治腫瘤已成為全球的熱點(diǎn)課題.目前，手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療及放射治療仍是腫瘤疾病治療的主要手段.但是，手術(shù)治療給機(jī)體帶來(lái)的創(chuàng)傷性，放射治療時(shí)射線對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞活力的嚴(yán)重?fù)p傷以及化學(xué)藥物對(duì)機(jī)體造成的免疫系統(tǒng)損害，都限制了腫瘤的治療效果，也給病患帶來(lái)了巨大的身體痛楚和精神壓力.

鑒于上述腫瘤治療方法的毒副作用，將有益于機(jī)體健康的中草藥與之聯(lián)合的綜合治療手段已受到越來(lái)越多地重視.靈芝(Ganoderma lucidum)作為我國(guó)具有悠久歷史的名貴中草藥，在對(duì)腫瘤的聯(lián)合治療方面效果突出.陳小君等［1］的研究表明，將中藥?kù)`芝孢子粉與抗腫瘤西藥環(huán)磷酰胺聯(lián)合作用于肝癌荷瘤小鼠，不僅能明顯增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抑瘤效用，同時(shí)可減輕因其造成的小鼠脫毛和松毛現(xiàn)象.張東健等［2］將以靈芝為主要成分的靈芝扶正膠囊運(yùn)用于食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、卵巢癌等癌癥患者的臨床治療中，發(fā)現(xiàn)該膠囊可改善大部分患者的治療狀況，減輕化療藥物所致的惡心嘔吐現(xiàn)象和免疫力降低等副作用，有效提升了患者的生活質(zhì)量.雖然靈芝具有較佳的輔助化學(xué)藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的作用，但因其較高的原料價(jià)格和較低的提取物得率，使得靈芝提取物的成本昂貴，給使用者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).因此，獲得成本低廉、腫瘤治療效果與靈芝提取物相當(dāng)?shù)闹兴幖捌鋸?fù)配物就顯得尤為重要.

黃芪(Astragalus)性微溫、味甘、入脾、歸肺經(jīng)，可補(bǔ)諸虛不足，益元?dú)?、壯脾胃、去肌熱、排膿止痛、活血生血?］.黃芪因其較佳的滋養(yǎng)補(bǔ)虛功效和較便宜的市場(chǎng)價(jià)格深受人們的喜愛(ài).將黃芪和靈芝制成復(fù)配物，在達(dá)到與等量單味靈芝相近的治療劑量時(shí)，能大大降低單味靈芝的使用成本，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.因此，利用成本低廉的黃芪提取物代替部分靈芝提取物，在提高環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤小鼠的療效上能否與單味靈芝相當(dāng)，靈芝和黃芪兩味中藥之間是否存在協(xié)同效應(yīng)，是本工作的主要研究?jī)?nèi)容.本工作將靈芝、黃芪及其復(fù)配物分別與抗腫瘤西藥共同作用于S180荷瘤小鼠，研究其抗腫瘤作用以及提高機(jī)體免疫、減輕化學(xué)藥物免疫副作用的能力，為靈芝黃芪復(fù)配物的輔助腫瘤治療及復(fù)健保健作用提供重要資料.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重20±2 g昆明種雄性小鼠，體重25±2 g昆明種雌雄性小鼠，S180腹水瘤小鼠均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK(滬)2007-0005.

藥品與試劑：靈芝精粉，福州東星生物技術(shù)有限公司;黃芪總提取物，實(shí)驗(yàn)室自制;環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

儀器：KX-21N型血常規(guī)分析儀，希森美康醫(yī)用電子有限公司;CA-920-3型超凈工作臺(tái)，上海上凈凈化設(shè)備有限公司;MP200B電子分析天平，上海億測(cè)電子設(shè)備有限公司;DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦滬西儀器廠;SHZ-3循環(huán)水真空泵，上海錦旻科學(xué)儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪總提取物的提取

本實(shí)驗(yàn)采用95%乙醇索氏提取和水熱回流兩步提取法.將黃芪加工成粉粒狀，過(guò)60目篩，以95%乙醇為溶劑，固液比為1∶10，置索氏提取器中提取;待提取溶劑接近于無(wú)色后，取出提取液，減壓蒸餾揮干溶劑.上述提取殘留物用10倍水量熱回流提取，提取溫度為90℃，分別提取2次，每次提取時(shí)間為3.5 h;合并提取液，減壓蒸餾回收溶劑.合并95%乙醇和水部位提取物，得到黃芪總提取物，計(jì)算得率.

1.2.2 靈芝黃芪復(fù)配物的急性毒性實(shí)驗(yàn)

遵循《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［4］的規(guī)定，采用急性毒性限量實(shí)驗(yàn)法.以10 g/kg小鼠體重的靈芝黃芪復(fù)配物灌胃小鼠，記錄小鼠2周內(nèi)的生活、中毒和死亡情況.

1.2.3 S180荷瘤小鼠模型制備

取7～8 d左右的S180腹水瘤小鼠，拉頸椎處死，置于75%乙醇溶液中.在無(wú)菌條件下吸取瘤液，無(wú)菌生理鹽水稀釋至2×107后，接種于小鼠右前肢腋窩皮下，劑量為0.1 mL/只，建立S180荷瘤小鼠模型.

1.2.4 動(dòng)物分組及給藥方法

將小鼠隨機(jī)分為8組：①靈芝+CTX組，②黃芪+CTX組，③靈芝黃芪復(fù)配物低劑量+CTX組，④靈芝黃芪復(fù)配物中劑量+CTX組，⑤靈芝黃芪復(fù)配物高劑量+CTX組，⑥單CTX組，⑦模型組，⑧正常組.每組有8只小鼠，其中①～⑤組于小鼠腋下注瘤24 h后，每日灌胃相應(yīng)中藥.①組、②組和④組的給藥劑量皆為500 mg/kg;③組和⑤組的給藥劑量分別為250和1 000 mg/kg;⑥組灌胃等劑量生理鹽水.除此以外，①～⑦組每日同時(shí)腹腔注射CTX，劑量為30 mg/kg.以上各組處理時(shí)間相同.

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo)

14 d后，將小鼠摘眼球取血，測(cè)定小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)數(shù)和紅細(xì)胞(RBC)數(shù).解剖小鼠，取小鼠脾臟和胸腺，測(cè)定小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù).剝瘤，記錄小鼠腫瘤重量，并計(jì)算抑瘤率.各檢測(cè)指標(biāo)計(jì)算如下：

抑瘤率(%)=(模型組平均瘤重-各藥物組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%;

脾指數(shù)(mg/g)=小鼠脾重(mg)/小鼠體重(g);

胸腺指數(shù)(mg/g)=小鼠胸腺重(mg)/小鼠體重(g).

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法

本研究采用mean±SD表示數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)間用t檢驗(yàn)判斷其差異顯著性，其中若P＜0.05，表示有顯著性差異;P＜0.01，表示有極顯著性差異.

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.3.1 黃芪總提取物的提取

經(jīng)95%乙醇索氏提取和水熱回流兩步提取法，可得黃芪總提取物的提取率為39.1%.

1.3.2 靈芝黃芪復(fù)配物的急性毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠經(jīng)靈芝黃芪復(fù)配物灌胃后，14 d內(nèi)體重增長(zhǎng)正常，毛色光亮，活動(dòng)自如，行為、精神狀態(tài)正常，攝食飲水情況良好，無(wú)震顫、扭體及翹尾，鼻、眼、口腔無(wú)異常分泌物，未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)、毒性反應(yīng)和死亡情況.14 d后斷頸處死，經(jīng)解剖和尸檢未發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟器官異常.以上結(jié)果表明，靈芝黃芪復(fù)配物在治療劑量范圍內(nèi)是安全、無(wú)毒的.

1.3.3 靈芝黃芪復(fù)配物聯(lián)合CTX對(duì)小鼠腫瘤的影響

如表1所示，與模型組相比，各中藥聯(lián)合CTX組及單CTX組皆能顯著抑制小鼠移植性S180肉瘤的生長(zhǎng)(P＜0.01)，顯示出CTX在抗腫瘤作用中的優(yōu)勢(shì).而與單CTX組74.6%的抑瘤率相比，各靈芝黃芪中藥復(fù)配物顯示出了不同程度的抑瘤增效作用，具有一定的劑量依賴性，其中以靈芝黃芪復(fù)配物中、高劑量聯(lián)合CTX組抑制小鼠S180肉瘤生長(zhǎng)的效果較佳，其抑瘤率分別達(dá)到了82.0%和84.4% (P＜0.01).靈芝素來(lái)有抗腫瘤佳品的美稱，在本研究中，其輔助CTX對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率可達(dá)至82.4%.等劑量的靈芝黃芪復(fù)配物，雖用抗腫瘤效果相對(duì)較弱的黃芪代替了部分靈芝，但82.0%的抑瘤率仍與單味靈芝相當(dāng)，組間無(wú)顯著性差異.

表1 靈芝黃芪復(fù)配物協(xié)同CTX對(duì)小鼠抑瘤率的影響(n=8)Table 1 Effects of the compound of Ganoderma lucidum and Astragalus extracts on tumor of mice cooperated with CTX(n=8)

1.3.4 靈芝黃芪復(fù)配物聯(lián)合CTX對(duì)小鼠免疫器官的影響

如表2所示，各中藥聯(lián)合CTX組以及單CTX組的胸腺指數(shù)皆低于模型組(P＜0.01)，證明了CTX的存在所造成的小鼠機(jī)體免疫副作用——胸腺萎縮.與單CTX組1.14 mg/g的胸腺指數(shù)相比，靈芝黃芪復(fù)配物中、高劑量聯(lián)合CTX組皆可極顯著地緩解CTX的副作用，使其胸腺指數(shù)分別達(dá)到了1.63和1.58 mg/g(P＜0.01).此外，由表2還可看到，靈芝黃芪復(fù)配物中劑量聯(lián)合 CTX組的胸腺指數(shù)為1.63 mg/g，甚至高于單味靈芝聯(lián)合 CTX組的1.58 mg/g，體現(xiàn)出了靈芝黃芪復(fù)配物在緩解CTX對(duì)小鼠胸腺免疫副作用上的優(yōu)勢(shì).

在小鼠脾指數(shù)上，CTX的存在同樣會(huì)造成小鼠的脾臟損傷，使各中藥聯(lián)合CTX組以及單CTX組的脾指數(shù)低于模型組(P＜0.05).與單CTX組相比，靈芝黃芪復(fù)配物聯(lián)合CTX各組可劑量依賴性地增大小鼠的脾指數(shù)，其中靈芝黃芪復(fù)配物高劑量聯(lián)合CTX組的脾指數(shù)為 8.63 mg/g，與單 CTX組的6.87 mg/g相比，具有顯著差異性(P＜0.05)，而其他各組則未能明顯地表現(xiàn)出對(duì)CTX損傷的緩解作用.

表2 靈芝黃芪復(fù)配物協(xié)同CTX對(duì)小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(n=8)Table 2 Effects of the compound of Ganoderma lucidum and Astragalus extracts on the thymus index and spleen index of mice cooperated with CTX(n=8)

1.3.5 靈芝黃芪復(fù)配物聯(lián)合CTX對(duì)小鼠白細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)的影響

如表3所示，各中藥聯(lián)合CTX組以及單CTX組均能顯著降低小鼠血液的白細(xì)胞數(shù)(P＜0.01)和紅細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)，證明了CTX在治療過(guò)程中會(huì)造成機(jī)體的白細(xì)胞和紅細(xì)胞減少癥.而靈芝黃芪復(fù)配物聯(lián)合CTX組能劑量依賴性地緩解CTX的此種免疫副作用，其高劑量組在增加機(jī)體血液白細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)上皆具有顯著性差異(P＜0.05).另外，靈芝黃芪復(fù)配物中劑量聯(lián)合 CTX組的白細(xì)胞數(shù)5.08×109/L和紅細(xì)胞數(shù)6.60×1012/L，均略低于等劑量的單味靈芝聯(lián)合 CTX組的5.10×109/L和6.61×1012/L，證明了其在減輕由CTX所造成的白細(xì)胞和紅細(xì)胞減少癥上可媲美單味靈芝組.

2 討論

靈芝、黃芪皆為我國(guó)名貴中草藥，根據(jù)其中藥特點(diǎn)和市場(chǎng)情況，將二者制成中藥復(fù)配物，具有藥性協(xié)同的潛力和巨大的經(jīng)濟(jì)效益.基于此目的，本實(shí)驗(yàn)室一直致力于靈芝黃芪復(fù)配物抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的研究.通過(guò)前期大量的篩選實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)室選出了實(shí)驗(yàn)中靈芝黃芪復(fù)配物抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的最佳比例，應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)研究中.

表3 靈芝黃芪復(fù)配物協(xié)同CTX對(duì)小鼠白細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)的影響(n=8)Table 3 Effects of the compound of Ganoderma lucidum and Astragalus on extracts the amounts of the white blood cells and red blood cells in mice cooperated with CTX(n=8)

脾臟和胸腺是機(jī)體兩大免疫器官，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和免疫因子分泌方面不可獲缺.白細(xì)胞和紅細(xì)胞是機(jī)體主要的免疫活性細(xì)胞，二者共同在抗御病原的入侵和對(duì)疾病的免疫方面起著重要作用.本研究表明，靈芝黃芪復(fù)配物可不同程度地增加CTX治療的荷S180肉瘤小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、白細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù)等免疫指標(biāo)，反映出了復(fù)配物對(duì)機(jī)體免疫功能的提升作用.機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)，為腫瘤的防治以及化療藥物毒副作用的減輕創(chuàng)造了一個(gè)較好的內(nèi)環(huán)境.機(jī)體正氣內(nèi)存，邪不干正，這也可能是靈芝黃芪復(fù)配物具有較佳抑瘤效果的重要因素之一.

此外，本研究證明了單味黃芪組在輔助CTX抗腫瘤及在CTX治療中，提高小鼠免疫指標(biāo)的效果皆不如單味靈芝組.但是，將治療效果較弱的黃芪代替部分靈芝制成靈芝黃芪復(fù)配物后，卻在上述腫瘤和免疫指標(biāo)上可媲美同劑量的單味靈芝組，組間無(wú)顯著性差異，這表明靈芝和黃芪兩味中草藥之間產(chǎn)生了一定的協(xié)同作用.對(duì)此，我們推測(cè)可能有以下兩方面的原因.

首先，此作用可能與靈芝、黃芪兩味中藥在腫瘤防治和減輕化療藥物毒副作用上具有不同的作用偏向性有關(guān).靈芝在腫瘤治療中與其三萜類物質(zhì)的效用密不可分［5］.Gonzalez等［6］的研究表明，靈芝中的三萜類物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可以直接殺滅腫瘤細(xì)胞，是靈芝抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要因素.黃芪作為一種滋補(bǔ)壯氣類中藥，充分體現(xiàn)出了中醫(yī)扶正固本的特點(diǎn)，其主要活性成分皂甙、黃酮和多糖類成分能夠促進(jìn)機(jī)體抗體生成和體液免疫細(xì)胞增殖，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相應(yīng)補(bǔ)體受體的活性，通過(guò)誘導(dǎo)干擾素的生成，從多方面地調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力［7-9］，保持機(jī)體整體的健康活力.將黃芪和靈芝制成復(fù)配物，靈芝偏向“驅(qū)邪”，黃芪偏向“扶正”，驅(qū)邪扶正，齊頭并進(jìn)，互補(bǔ)互成，從而有效地提高了單味中藥抑制腫瘤生長(zhǎng)的功效，產(chǎn)生了一定的協(xié)同作用.祝絢等［10］將具有免疫活性的云芝糖肽和對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的丹參酮ⅡA運(yùn)用于荷瘤小鼠的腫瘤治療中，也發(fā)現(xiàn)其復(fù)配物具有一定的協(xié)同作用，且其作用機(jī)理與本實(shí)驗(yàn)中的靈芝黃芪復(fù)配物相似.

其次，王丹花等［11］研究表明，靈芝精粉氯仿提取物能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402和胃癌細(xì)胞MGC-803的生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抑癌活性.為了追蹤靈芝精粉中的抗癌活性物質(zhì)，陸易等［12］還對(duì)靈芝精粉進(jìn)行了分離純化，得到了偏脂溶性的單體靈芝萜烯酮醇和麥角甾7-22二烯3β醇.藥理研究發(fā)現(xiàn)，該化合物不僅能增強(qiáng)抗腫瘤藥物順氯氨鉑抵抗BEL-7402細(xì)胞的能力，具有正協(xié)同作用，還能促進(jìn)人微血管細(xì)胞HMEC的增長(zhǎng)，促進(jìn)人體健康.因此，將黃芪加入到靈芝中，從極性角度考慮，黃芪中的主要成分皂甙和黃酮化合物可能有利于溶解靈芝中的這些具有抗腫瘤效用的脂溶性有效成分，如靈芝三萜醇、靈芝酸等，從而加強(qiáng)了這些成分在機(jī)體內(nèi)的分散和吸收，這可能也是靈芝黃芪復(fù)配物具有輔助CTX抗腫瘤療效的又一原因.

3 結(jié)束語(yǔ)

靈芝黃芪復(fù)配物對(duì)CTX的抑瘤具有顯著的增效減毒作用，其抑制小鼠S180肉瘤生長(zhǎng)及減輕CTX免疫副作用的效果堪比同劑量的單味靈芝組，這為開(kāi)發(fā)具有輔助作用且價(jià)格低廉的抗瘤保健品提供了依據(jù).

［1］ 陳小君，史泓瀏，馮翠萍，等.靈芝孢子粉與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2005，13(1)：64-66.

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