蔡 靈， 吳曼麗， 范丹青， 楊 明

(1.廈門大學(xué)近海海洋國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005;2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海200444)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量未知模板的方法.該方法具有準(zhǔn)確、靈敏和簡便等特點(diǎn)，在微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測和基因表達(dá)研究等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值［1］.實(shí)時(shí)定量PCR方法分為以檢測目的基因自身含量的絕對(duì)定量和以內(nèi)參基因?yàn)閰⒈冗M(jìn)行的相對(duì)定量兩類.相對(duì)定量根據(jù)參照基因和目的基因的擴(kuò)增效率是否接近，又分為雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法和比較Ct(cycle threshold)相對(duì)定量法.在這兩個(gè)相對(duì)定量法中，當(dāng)目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率接近時(shí)，比較Ct相對(duì)定量法是公認(rèn)的得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為快捷和方便的方法［2］.因此，選擇合適的內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)合適的引物，建立合適的PCR反應(yīng)條件是實(shí)時(shí)定量PCR方法建立的重要環(huán)節(jié)［3］.

持家基因(house-keeping gene)又稱管家基因，是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因.超過90%的研究者使用3-磷酸甘油醛脫氫酶，β-actin，18S rRNA和28S rRNA作為參照基因進(jìn)行定量［4］.由于這些基因在個(gè)體各個(gè)生長階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)或變化很小，因此，其表達(dá)水平受環(huán)境因素的影響較小，只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制的調(diào)節(jié).上述管家基因可作為實(shí)時(shí)熒光定量的內(nèi)參基因，通過校正轉(zhuǎn)錄效率和起始模板的用量，使不同樣本目的基因的比較成為可能［5-6］.

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國沿海重要的經(jīng)濟(jì)魚類，但因酷漁濫捕，現(xiàn)今漁汛消失，野生大黃魚瀕臨絕跡.目前市售的大黃魚均以人工養(yǎng)殖為主，但由于其在養(yǎng)殖過程中較易受病害影響，因而導(dǎo)致養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)和成本較高，市售價(jià)格昂貴.開展大黃魚體內(nèi)免疫功能相關(guān)基因的研究，對(duì)人工養(yǎng)殖大黃魚的病害防治具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景.本研究克隆了內(nèi)參基因的序列，建立了大黃魚抗菌肽Hepcidin基因(pc-hepc)的實(shí)時(shí)相對(duì)定量分析方法，完成了大黃魚免疫器官中Hepcidin基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)定量分析.該工作不僅為開展Hepcidin抗菌肽基因表達(dá)特性等的研究奠定了基礎(chǔ)，而且為開展其他魚類中免疫相關(guān)基因體內(nèi)表達(dá)機(jī)制的研究提供了參照.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

大黃魚取自福建福州羅源灣養(yǎng)殖場，平均體重為40 g.

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，Sigma公司; Trizol試劑盒，Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa PMDT-18質(zhì)粒連接試劑盒、DNA Marker，大連寶生物公司;Qiaquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司;Power SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑，Applied Biosystem公司;DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，Roche公司;所有引物由上海生物工程有限公司合成;其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣本采集及其RNA提取

攻毒組(A組)大黃魚腹腔注射800 μg LPS，對(duì)照組(B組)注射等體積生理鹽水，48 h后采集樣品(樣品數(shù)量n=3).現(xiàn)場解剖，取頭腎組織樣品迅速放入液氮中，-80℃冰箱保存.使用Trizol試劑盒抽提RNA.核酸蛋白含量測定儀(GE公司)檢測RNA的濃度和質(zhì)量.

1.2.2 內(nèi)參基因(18S rRNA和β-actin)序列的獲得

根據(jù)GenBank中黑鯛Hepcidin基因的序列設(shè)計(jì)18S rRNA和β-actin基因的引物，如表1所示.使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并在PTC-200型PCR儀(MJ Research公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件為：94℃變性3 min;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃變性30 s，55℃退火40 s和72℃延伸1 min;最后，72℃延伸 5 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)Qiaquick Gel Extraction Kit回收純化后，使用TaKaRa PMDT-18載體連接試劑盒連接轉(zhuǎn)化，并由上海生工生物工程公司測序.

表1 用于序列擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量PCR的引物Table 1 Primers for sequence amplifications and real-time PCR

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

取500 ng大黃魚頭腎RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.經(jīng)優(yōu)化PCR條件后，按1 ng RNA轉(zhuǎn)錄為1 ng cDNA計(jì)算，取2 ng稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入20 μL反應(yīng)體系中，同時(shí)加入濃度為10 μM的上、下游引物各1 μL.使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR.PCR反應(yīng)條件為：60℃ 2 min，95℃ 10 min;隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃ 15 s，60℃ 1 min，并在60℃采集熒光信號(hào).PCR程序結(jié)束后，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線的測定，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s.

1.2.4 Northern-blot實(shí)驗(yàn)

采用 DIG HighPrimeDNA Labelingand Detection Starter KitⅠ試劑盒標(biāo)記Hepcidin探針.等量混合A組和B組各3條魚的頭腎RNA，并取40 μg總RNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，按試劑盒說明書進(jìn)行Northern-blot實(shí)驗(yàn).掃描Northern-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并使用Bio-Rad公司的Quantity One軟件對(duì)Northern-blot結(jié)果圖中的條帶進(jìn)行光強(qiáng)度分析，以確定各條帶的光強(qiáng)度及其占總光強(qiáng)度的比例.

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

以50 ng cDNA為起始量進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線.擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線使用Origin 7.0軟件繪制，橫坐標(biāo)為稀釋倍數(shù)的lg值，縱坐標(biāo)為熒光定量分析的Ct值.

使用比較Ct法分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)時(shí)，要求內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率一致.當(dāng)滿足上述條件時(shí)，取一個(gè)樣品的熒光值，用ΔCt(即目標(biāo)基因與內(nèi)參基因Ct值的差值)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化.比較不同的樣品相對(duì)量時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)化后的值，即不同樣品的ΔCt的差值進(jìn)行比較，即Δ(ΔCt)=ΔCt1-ΔCt2.最后，當(dāng)轉(zhuǎn)化成RNA水平實(shí)際變化倍數(shù)時(shí)，結(jié)果為Y= 2-Δ(ΔCt)［4］.本實(shí)驗(yàn)的相對(duì)定量數(shù)據(jù)以18S rRNA基因片段為內(nèi)參，采用B組第一條魚的Hepcidin表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化，采用2-Δ(ΔCt)方法進(jìn)行計(jì)算.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大黃魚頭腎總RNA的提取

紫外分光光度計(jì)測定總RNA的吸光值A(chǔ)260/A280在1.8～2.0之間，證明了所提取的RNA純度較高，無蛋白和DNA污染.取微量總RNA提取液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，rRNA具有完整帶型，證明提取的RNA較完整，無降解.

2.2 大黃魚18S rRNA和β-actin片段的cDNA序列及序列的同源性分析

經(jīng)過序列相似性比對(duì)分析，本實(shí)驗(yàn)首次擴(kuò)增出了大黃魚的18S rRNA和β-actin的cDNA序列片段，并已登錄GenBank獲得了登錄號(hào)，結(jié)果如表2所示.

表2 大黃魚18S rRNA和β-actin片段的序列相似性分析Table 2 Similarity analysis of 18S rRNA and β-actin fragments

2.3 大黃魚3種基因的擴(kuò)增和溶解曲線

圖1為多次重復(fù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物溶解曲線圖，其中凝膠電泳圖代表普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解曲線圖代表實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; M1為 100 bp ladder DNA Marker，M2為 DL2000 DNA Marker.可以看出，利用所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出的Hepcidin，18S rRNA和β-actin等目的基因片段，都具有各自單一的溶解溫度，分別為80，78和84℃; PCR反應(yīng)產(chǎn)物特異，并且瓊脂糖凝膠電泳也證明了其PCR產(chǎn)物單一，沒有二聚體的產(chǎn)生.

2.4 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量 PCR方法檢測大黃魚Hepcidin基因方法的建立

2.4.1 擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為大黃魚3種基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中x為模板基因的稀釋倍數(shù).由圖2(a)可見，18S rRNA基因擴(kuò)增曲線的斜率與Hepcidin基因斜率相差(Δk)僅為0.08，線性回歸系數(shù)差值(ΔR2)小于0.005，符合比較Ct法分析的要求.在圖2(b)中，β-actin基因擴(kuò)增曲線的斜率與Hepcidin基因斜率差為0.22，ΔR2也小于0.005.比較而言，18S rRNA更接近Hepcidin基因的擴(kuò)增效率，因此，更適合用于比較Ct法分析的實(shí)時(shí)定量PCR.

2.4.2 與Norther-blot結(jié)果的比較

為了驗(yàn)證大黃魚內(nèi)參基因18S rRNA用于實(shí)時(shí)熒光定量方法的可行性和有效性，將PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Northern-blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖3所示，其中A為對(duì)照組樣品，B為攻毒組樣品，M為RNA Marker 1000.結(jié)果表明，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析，攻毒組大黃魚經(jīng)LPS誘導(dǎo)，頭腎中的Hepcidin基因被誘導(dǎo)并升高至對(duì)照組的1.80倍;而利用Northern-blot方法分析，攻毒組大黃魚頭腎中的Hepcidin基因被誘導(dǎo)至對(duì)照組的2.11倍，證明兩種方法所得的結(jié)果基本一致.

圖1 普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖和實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物溶解曲線Fig.1 Agrose gel analysis and melting curve anlaysis of the PCR products

圖2 大黃魚3種基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Relative standard curves of the hepcidin，18S rRNA and β-actin genes from the large yellow croaker using real-time PCR

圖3 Hepcidin基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR結(jié)果與Northern-blot結(jié)果比對(duì)Fig.3 Comparison ofthe hepcidin gene quantity obtained from real-time PCR and Northern-blot

3 討論

本研究建立了大黃魚Hepcidin抗菌肽基因?qū)崟r(shí)熒光相對(duì)定量分析方法，與傳統(tǒng)的Northern-blot半定量基因表達(dá)方法相比，本方法利用了內(nèi)參基因進(jìn)行校正，使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠.由于Northern-blot實(shí)驗(yàn)直接操作RNA進(jìn)行電泳，而RNA又極易在實(shí)驗(yàn)中降解，因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)者的實(shí)驗(yàn)技能和對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的控制要求較嚴(yán)格.同時(shí)，Northern-blot的每個(gè)樣品的RNA用量，如本實(shí)驗(yàn)中的40 μg總RNA上樣量，遠(yuǎn)大于熒光定量PCR的500 ng總RNA初始量.因此，在操作大量基因的表達(dá)檢測時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比傳統(tǒng)的Northern-blot方法，優(yōu)勢非常明顯.

抗菌肽Hepcidin是一種重要的先天性免疫因子，于2000年由Krause從人類血漿中分離出來.由于抗菌肽在肝臟表達(dá)，因此，被命名為Hepcidin或LEAP-1(liver expressed antimicrobial peptide)［7］.隨后，在小鼠、豬、狗等多個(gè)哺乳動(dòng)物物種中均發(fā)現(xiàn)了這一抗菌肽的存在［8-10］.2002年，Shike等［11］在細(xì)菌誘導(dǎo)的雜交斑紋鱸魚(Morone saxatilis×Morone chrysops)鰓中發(fā)現(xiàn)了魚類中的第一個(gè)Hepcidin抗菌肽.此后，在大西洋鱈魚(Gadus morhua)［12］、花鱸(Lateolabrax japonicus)［13］、 黑 鯛 (Sparus macrocephlus)［14-16］等多種魚類中也發(fā)現(xiàn)了這一抗菌肽的存在.Hepcidin家族的抗菌肽是一種保守的富含半胱氨酸，具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的抗菌肽.研究表明，Hepcidin抗菌肽在人體等哺乳動(dòng)物中是一種調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)和一種極為重要的鐵代謝調(diào)激素［7-10］.在魚類中，Hepcidin抗菌肽在先天免疫相關(guān)方面發(fā)揮著更為廣泛的作用.魚類體內(nèi)存在多個(gè)Hepcidin抗菌肽變體，細(xì)菌、致炎物質(zhì)等均可影響Hepcidin在魚體內(nèi)各器官組織中的表達(dá)合成［16］.研究發(fā)現(xiàn)，Hepcidin的不同變體不僅可以誘發(fā)免疫相關(guān)基因的表達(dá)合成，同時(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞的活性，并在病毒感染細(xì)胞后起到保護(hù)細(xì)胞抵抗病毒侵染的作用［17-18］.這些研究進(jìn)一步證實(shí)了Hepcidin抗菌肽對(duì)魚類先天免疫作用的重要性.

4 結(jié)束語

開展大黃魚體內(nèi)Hepcidin基因的研究，利用本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量分析方法對(duì)其基因進(jìn)行定量檢測，可以更加深入地了解大黃魚抗菌肽的表達(dá)情況，為進(jìn)一步開展大黃魚的先天免疫機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ).Hepcidin抗菌肽在大黃魚中的研究不僅對(duì)減少大黃魚養(yǎng)殖病害有所助益，同時(shí)也對(duì)其他養(yǎng)殖魚類的病害防治具有普遍的意義.

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