趙靜姝，王 蓉，張景燕，吳燕川，姬志娟

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室，老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實驗室，北京 100053)

熱量限制(caloric restriction，CR)是指一種有計劃的減少由食物提供的熱量的進(jìn)食方式，一般是指在生物體所攝入營養(yǎng)成分保證其不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，將正常自由進(jìn)食(ad libitum，AL)所得熱量減去30%～50%。最早由McCay等人于上世紀(jì)30年代提出，并發(fā)現(xiàn)這種進(jìn)食方式可以延長小鼠的平均壽命和最長壽命［1］。

CR的研究多集中在各種動物模型中，CR可以降低體重，下調(diào)血壓，降低空腹血糖、胰島素和膽固醇水平，維持年輕的生理狀態(tài)［2］。對恒河獼猴進(jìn)行長達(dá)20多年的CR研究發(fā)現(xiàn)，CR可降低恒河獼猴糖尿病、癌癥、心血管疾病和腦萎縮等多種年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生并延緩衰老［3］，并對很多年齡相關(guān)的如紋狀體體積下降，運(yùn)動功能遲緩，機(jī)體免疫系統(tǒng)下降等都有改善作用［4］。

目前對于熱量限制的體外細(xì)胞模型的研究報道較少，本實驗旨在通過降低培養(yǎng)液中細(xì)胞的主要能量消耗來源葡萄糖的方式建立SH-SY5Y細(xì)胞熱量限制模型，進(jìn)一步探討CR對細(xì)胞生長的影響，并為下一步探討CR對人體各種作用的作用機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)，提供良好的體外模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。

1.1.2 試劑：噻唑蘭 (MTT)購自Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購自北京亞太精細(xì)化工公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自北京化工廠，編號001012。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：正常對照組細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM ×F12(Gibco)培養(yǎng)基中加入10% 胎牛血清、青霉素100IU/m L、鏈霉素100IU/m L于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6天傳代1次，中間換液1次。高糖組與低糖組培養(yǎng)基分別為DMEM(4.5g/L L-glucose)和DMEM(2.0g/L L-glucose)加10%胎牛血清，余與正常對照組相同。

1.2.2 MTT代謝率測定：將SH-SY5Y細(xì)胞以2× 103/m L接種于96孔板(Costar產(chǎn)品)，分為以上三組，每組12孔，培養(yǎng)3d后統(tǒng)一換成DMEM ×F12無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后做MTT代謝率測定，每孔加MTT(5mg/m L)20μL，37℃孵育4h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μL，振搖10min，用全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum)測定550nm處光密度值(A)。

1.2.3 細(xì)胞生長形態(tài)觀察及細(xì)胞計數(shù)：將 SHSY5Y細(xì)胞以2×102/m L接種于6孔板(Costar產(chǎn)品)，分為以上3組，每組8孔，自接種后第3、5、7、9、11、13、15、16天時，用倒置顯微鏡(Olympus產(chǎn)品)觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用臺盼藍(lán)染色計數(shù)法計算細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 LDH漏出率測定：將細(xì)胞計數(shù)實驗中各孔細(xì)胞培養(yǎng)液收集，按照 LDH測定試劑盒所示方法(比色法)，測定550nm處光密度值，同時做LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計分析，資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析(One Way ANOV)及重復(fù)資料的方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義，P＜0.01認(rèn)為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測定

結(jié)果顯示高糖組A值為0.573±0.001，低于對照組(0.742±0.003)，降低幅度為22.78%，兩組相比P＜0.01；低糖組 A值為0.428±0.003，低于對照組，降低幅度為 42.32%，兩組相比 P＜0.01。(圖1)

2.2 細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞生長曲線如圖2所示，在生長初期，各組細(xì)胞均隨生長天數(shù)延長，數(shù)目顯著增多，到第11天左右，各組細(xì)胞達(dá)到生長頂峰，隨后各組細(xì)胞以不同速度死亡。其中與對照組相比，高糖組細(xì)胞生長略慢，當(dāng)達(dá)到頂峰后，細(xì)胞死亡明顯，細(xì)胞數(shù)目下降幅度較大。而低糖度細(xì)胞總體生長過程緩慢，在達(dá)到頂峰以后，細(xì)胞死亡不太明顯，而且在實驗觀察終點(diǎn)，低糖組細(xì)胞數(shù)目高于對照組和高糖組，說明低糖生長環(huán)境下細(xì)胞生長慢，代謝速度低，對衰老的細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用，降低細(xì)胞的死亡速度。

圖1 不同能量對SH-SY5Y細(xì)胞生長代謝率的影響Fig.1 Effect of different energy supplies on the metabolic rate of SH-SY5Ycells注：與對照組相比，＊＊P＜0.01Note：＊＊P＜0.01，compared with the control group

圖2 不同能量組細(xì)胞生長曲線Fig.2 The cell growth curves of different groups

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖3所示為各組細(xì)胞在不同生長階段時的細(xì)胞形態(tài)。圖3.1所示為生長初期第3天的細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞數(shù)目尚少，細(xì)胞在6孔板中分布集中，成簇生長，低糖組細(xì)胞數(shù)目明顯較其他兩組少。圖3.2所示為生長中期第11天的細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)，數(shù)目達(dá)到頂峰，細(xì)胞生長良好，尤其是低糖組的細(xì)胞突起伸展良好細(xì)長，而高糖組細(xì)胞的突起則相對縮短，不明顯。圖3.3所示為生長末期第16天時細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞之間差異比較明顯，高糖組細(xì)胞死亡顯著，視野中僅殘存少量活細(xì)胞，對照組細(xì)胞死亡相對較少，但是細(xì)胞已經(jīng)有皺縮，突起結(jié)構(gòu)消失，失去活性，臺盼藍(lán)染色時著色較深，低糖組細(xì)胞較對照組和高糖組細(xì)胞死亡數(shù)目少，活性好(圖3見文后彩插3)。

2.4 LDH漏出率測定結(jié)果

圖4所示為各組細(xì)胞在不同生長階段的LDH漏出率測定結(jié)果。高糖組的LDH漏出率始終較其他兩組高，說明高糖組代謝快，而且在生長階段的初期，高糖組與對照組相比，LDH漏出率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在生長階段后期高糖組和正常組細(xì)胞較低糖組受損明顯，代謝產(chǎn)生的廢物等致使細(xì)胞生長環(huán)境變差，不利于細(xì)胞生長，從而使細(xì)胞大量死亡，LDH漏出顯著，而低糖組細(xì)胞則因代謝緩慢，整個生長環(huán)境相對平衡，從而細(xì)胞在生長后期仍能保持良好的生長狀態(tài)，LDH漏出率與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而且LDH漏出率的結(jié)果與生長曲線相結(jié)合來看結(jié)果是一致的。

圖4 不同能量組LDH漏出率的測定結(jié)果Note：＊＊P＜0.01，the high glucose group compared with the control group；★★P＜0.01，the low glucose group compared with the control group.Fig.4 The cell LDH leakage rates in different groups

3 討論

熱量限制(30% ～50%)這種對機(jī)體的干預(yù)方式的有利作用已經(jīng)在各種生理和病理動物模型中得到驗證，作用廣泛，涉及到延緩衰老、對抗各種老年性疾病，使機(jī)體保持年輕生理狀態(tài)等。其中熱量限制對于改善動物認(rèn)知功能，預(yù)防和改善神經(jīng)退行性疾病的作用也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其細(xì)胞形態(tài)及生理、生化功能與正常神經(jīng)元相似，已廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)的研究。本實驗遵循熱量限制的定義，將在體適度熱量限制轉(zhuǎn)換成降低細(xì)胞體外培養(yǎng)條件中葡萄糖的濃度，將一般體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y葡萄糖濃度從 3.15g/L下降到 2g/L (36%熱量限制)，觀察這樣的條件對細(xì)胞基本生長情況的影響，并采用高糖培養(yǎng)條件作為陽性對照，應(yīng)用MTT代謝率測定，細(xì)胞生長曲線及LDH漏出率測定等基本指標(biāo)對這一體外模型進(jìn)行評價。

本實驗觀察到低糖培養(yǎng)條件下MTT代謝率測定結(jié)果低，細(xì)胞代謝緩慢，在整個生長周期中，細(xì)胞生長緩慢，生長環(huán)境相對穩(wěn)定，該組細(xì)胞保持了較恒定的細(xì)胞生長能力和修復(fù)能力，雖然早期細(xì)胞生長較慢，但是其保持了一定的增殖潛力，在實驗?zāi)┢谙鄬τ谄渌麅山M死亡不明顯，LDH漏出率偏低，殘存有活性的細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞形態(tài)仍較年輕，如突起伸展良好。我們得到的結(jié)論是低糖培養(yǎng)條件不但不會對細(xì)胞造成損傷，反而起到一定程度的保護(hù)作用，延緩細(xì)胞進(jìn)入衰老階段的進(jìn)程，讓細(xì)胞處在有活力的生長階段。這一結(jié)論與CR在動物實驗中的研究結(jié)論相一致［6］，CR可以使機(jī)體延緩衰老，可能就是CR使細(xì)胞保持了年輕的生理狀態(tài)，從而使得整個機(jī)體處于協(xié)調(diào)狀態(tài)，更有效的延長壽命，延緩衰老。

在上述低糖培養(yǎng)條件對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y降低代謝，保護(hù)其生長能力的同時，作為陽性對照的高糖培養(yǎng)條件顯示了一系列相反的作用，高糖培養(yǎng)條件可以導(dǎo)致細(xì)胞衰老加快，LDH漏出率增加，死亡加速，和既往報道結(jié)果一致［7］。

熱量限制對機(jī)體的各種作用機(jī)制已經(jīng)被人們研究了70多年，仍然未完全得以闡述，本實驗通過建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y熱量限制模型，可在相對簡單可控條件下進(jìn)行生長、代謝以及深入分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的一系列細(xì)胞和分子水平的研究，為熱量限制對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了基礎(chǔ)支持。

［1］McCay CM，Crowell MF，Maynard LA.The effect of retarded growth upon the length of life and upon ultimate size.1935［J］.Nutrition，1989，5(3)：155-171.

［2］Ding Q，Ash C，M racek T，et al.Caloric restriction increases adiponectin expression by adipose tissue and prevents the inhibitory effect of insulin on circulating adiponectin in rats［J］.J Nutr Biochem，2011，［Epub ahead of print］.

［3］Colman RJ，Anderson RM，Johnson SC，et al.Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys［J］.Science，2009，325(5937)：201-204.

［4］Matochik JA，Chefer SI，Lane MA，et al.Age-related decline in striatal volume in rhesus monkeys：assessment of long-term calorie restriction［J］.Neurobiol Aging，2004，25(2)：193-200.

［5］Colman RJ，Beasley TM，Allison DB，et al.Attenuation of sarcopenia by dietary restriction in rhesus monkeys［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2008，63(6)：556-559.

［6］Edward JM.Overview of caloric restriction and aging［J］.Mechanisms Aging Dev，2005，126(9)：913-922.

［7］王蓉，張景艷，張岱，等.APP17肽對高糖引起神經(jīng)毒作用的影響［J］.中國糖尿病雜志，2000，8(3)：168-170.