張愛(ài)平 宋玉娥 宋冬梅

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古包頭 014010

支氣管哮喘患兒外周血MIF含量分析

張愛(ài)平 宋玉娥 宋冬梅

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古包頭 014010

目的 觀察巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）在支氣管哮喘患兒外周血中的含量及其意義。方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定支氣管哮喘患兒急性發(fā)作期和緩解期以及健康對(duì)照組外周血MIF的含量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 外周血中MIF的含量：支氣管哮喘患兒急性期組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；支氣管哮喘患兒緩解期組明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；支氣管哮喘患兒急性期組明顯高于緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論MIF參與了兒童支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展等病理生理過(guò)程，并與其分期相關(guān)。

兒童；支氣管哮喘；巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子；酶聯(lián)免疫法

近年來(lái)相關(guān)研究表明支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，它已經(jīng)成為一個(gè)日趨嚴(yán)重且不可忽視的全球性衛(wèi)生問(wèn)題。目前全世界大約有3億人患支氣管哮喘，其中兒童患者就有1.5億，占全球人口的5%。支氣管哮喘作為兒科最常見(jiàn)疾病之一，嚴(yán)重地影響了兒童的生長(zhǎng)發(fā)育和身心健康，一部分兒童哮喘還可遷延至成人哮喘，對(duì)患兒家庭和社會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。支氣管哮喘為多種炎癥細(xì)胞（特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞）參與、有多種炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的、并與遺傳和環(huán)境等多種因素相關(guān)的慢性氣道炎癥反應(yīng)。其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，在哮喘復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，MIF（巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子）起著關(guān)鍵作用，MIF是一種高度多變的蛋白質(zhì)，它既是一種前炎癥因子、神經(jīng)內(nèi)分泌激素和酶，同時(shí)還可以作為糖皮質(zhì)激素生理活動(dòng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。本研究通過(guò)測(cè)定外周血MIF的含量，來(lái)探討其在兒童支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的可能作用，并評(píng)價(jià)其反應(yīng)兒童支氣管哮喘氣道炎癥的嚴(yán)重性以及臨床分期的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例組 選取100例2009年11月～2011年12月在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科門診及病房治療的支氣管哮喘急性發(fā)作期患者作為急性期患者，其中，男56例，女44例，平均年齡（3.7±2.5）歲；選取50例緩解期患者，男 23例，女 27 例，平均年齡（4.27±3.20）歲。

入選標(biāo)準(zhǔn)：符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡0～14歲，不伴其他感染性及免疫性疾病。且所有急性期患者近4個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)激素和免疫調(diào)節(jié)劑。

1.1.2 正常對(duì)照組 對(duì)照組30例患者，均為在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科門診健康體檢的兒童。男15例，女15例，平均年齡（3.9±2.4）歲。 體格檢查正常，無(wú)濕疹、過(guò)敏性鼻炎等免疫性疾病史及相關(guān)疾病家族史。近1個(gè)月無(wú)上呼吸道感染性疾病，與病例組間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集及保存 急性發(fā)作期患者、緩解期患者（指導(dǎo)其規(guī)律霧化吸入糖皮質(zhì)激素40 d后）和對(duì)照組分別留取空腹靜脈血2 mL，1 500 r/min離心10 min，分別提取上層血清，分裝至200 μL EP管中，置于-70℃冰箱保存。

1.2.2 測(cè)定步驟MIF檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于美國(guó)R&D System公司，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked imunosorbent assay，ELISA）測(cè)定。（1）從冰箱內(nèi)取出待測(cè)樣品，平衡至室溫。（2）取出試劑盒，室溫放置30 min。（3）取出酶標(biāo)板依次編號(hào)，并設(shè)空白孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔。（4）加樣：①空白孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗MIF抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；②標(biāo)準(zhǔn)品孔，加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，鏈霉素-HRP 50 μL；③待測(cè)樣品孔：加入樣本 40 μL，然后加入抗-MIF 抗體 10 μL、鏈霉素-HRP 50 μL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60 min。（5）配液：將30倍的濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。（6）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。（7）顯色：每孔加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色 10 min。 （8）終止：每孔加入終止液 50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色）。 （9）測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定在加終止液后10 min內(nèi)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，支氣管哮喘患兒急性期與對(duì)照組比較，MIF升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=-1.171 22，P=0.000 8，P<0.05）；支氣管哮喘患兒緩解期與對(duì)照組比較，MIF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=-0.623 40，P=0.000 2，P<0.05）；支氣管哮喘患兒急性期與緩解期比較，MIF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.547 82，P=0.000 3，P<0.05），見(jiàn)表1，圖 1。

表1 不同時(shí)期哮喘組與對(duì)照組患者外周血MIF的結(jié)果比較（±s，ng/mL）

表1 不同時(shí)期哮喘組與對(duì)照組患者外周血MIF的結(jié)果比較（±s，ng/mL）

組別 例數(shù)（n） MIF（OD值）哮喘急性期哮喘緩解期對(duì)照組100 50 30 1.753±0.511 1.205±0.630 0.582±0.508

3 討論

支氣管哮喘是一種以血清IgE增高、肺組織嗜酸性粒細(xì)胞侵潤(rùn)、黏液高分泌和氣道高反應(yīng)為顯著特征的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究表明，MIF可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展等病理生理過(guò)程。 它的促炎反應(yīng)活性常和促進(jìn) TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-c、黏附因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)聯(lián)系在一起。目前大量文獻(xiàn)資料證實(shí)MIF參與了過(guò)敏性氣道炎癥的病理生理過(guò)程。MIF在支氣管哮喘中發(fā)揮作用的機(jī)制與嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及IgE密切相關(guān)。早在1998年Rossi AG等[1]研究發(fā)現(xiàn)正常人外周血中嗜酸性粒細(xì)胞中含有MIF前體。隨后Yamaguchi E[2]、Magalhates ES等[3]分別從臨床和動(dòng)物水平證實(shí)了MIF與支氣管哮喘明顯相關(guān)，且與嗜酸性粒細(xì)胞有密切的正相關(guān)關(guān)系。Kobayash IM等[4]對(duì)哮喘大鼠的肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞明顯高于對(duì)照組，并且應(yīng)用MIF抗體治療后上述細(xì)胞明顯下降。還有一部分國(guó)外學(xué)者研究MIF與IgE的關(guān)系，Mizue Y等[5-8]在基因水平對(duì)哮喘模型鼠研究發(fā)現(xiàn)，MIF與IgE有一定的聯(lián)系，但也有相反的結(jié)果。Magalhaes ES等[3]同樣對(duì)哮喘模型鼠研究發(fā)現(xiàn)，MIF與IgE無(wú)明顯差別。故對(duì)MIF與IgE的關(guān)系現(xiàn)在尚無(wú)定論。近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者李延紅等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血MIF濃度及PBMC中MIFmRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組。但關(guān)于支氣管哮喘患者外周血MIF含量與支氣管哮喘病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究。

以上研究結(jié)果都是以成人哮喘和動(dòng)物為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)0.6～13歲支氣管哮喘兒童，測(cè)定其外周血中MIF含量，分析正常對(duì)照組和支氣管哮喘組MIF含量之間的差異，結(jié)果顯示：支氣管哮喘患兒急性期與對(duì)照組比較，MIF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）；支氣管哮喘患兒緩解期與對(duì)照組比較，MIF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。與李延紅等人的研究結(jié)果一致。提示MIF在兒童支氣管哮喘中也起了重要作用，參與了兒童支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展等病理生理過(guò)程。另外本實(shí)驗(yàn)中支氣管哮喘患兒急性期與緩解期比較，MIF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。進(jìn)而筆者推測(cè)外周血中MIF含量與兒童支氣管哮喘的分期相關(guān)，提示MIF可作為兒童支氣管哮喘的輔助診斷以及臨床分期的指標(biāo)之一。但MIF含量與兒童支氣管哮喘病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量并進(jìn)一步細(xì)化分級(jí)研究。

[1]Rossi AG，Haslett C，Hirani N，et al．Human circulating eosinophils secrete maerophage migration inhibitory factor （MIF）．Potential role in asthma[J]．J Clin Invest，1998，101（12）：2869-2874．

[2]Yamaguchi E，Nishihira J，Shimizu T，el al．Macrophage miation inhibitory fnetor（MIF）in bronchial asthma[J]．Clin Exp Allergy，2000，30（9）：1244-1249．

[3]Magalhaes ES，Mourao-sa DS，Vieira-de-Abreu A，et al．Macrophage migration inhibitory factor is essential for allergic asthma but not for Th2 differentiation[J]．Eur JImmunol，2007，37（4）：1097-1106．

[4] Kobayassh IM，Nasuhaya Y，Kamachi A，et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in ovalbumin-induced air way inflammation in rats[J].EurRespir J， 2006， 27（4）：726-734.

[5]Mizue Y，Glumi s，Leng L，et al．Role for maerophage migration inhibitory factor in asthma[J]．Proe Nail Aead Sci USA，2005，102（40）：14410-14415．

[6]陳培芬，羅雅玲，賴文巖，等.慢性哮喘小鼠肺組織巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)及地塞米松對(duì)其的調(diào)節(jié)[J].廣東醫(yī)學(xué)，2009，30（3）：338-341.

[7]李延紅，宋衛(wèi)東，徐平，等.支氣管哮喘患者外周血巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)及意義[J].中華哮喘雜志，2009，3（3）：194-196.

[8]原樹云.哮喘患兒血清IL-10、IL-4與IgE水平的檢測(cè)及意義[J].河南醫(yī)學(xué)研究，2009，18（1）：16-18.

Analysis of serum MIF content levels in children with asthma

ZHANG AipingSONG Yu'eSONG Dongmei
First Affiliated Hospital of Baotou Medical College in Nei Monggol Autonomous Region,Baotou 014010,China

ObjectiveTo investigate the serum levels of MIF in children with asthma and its significance.MethodsMIF expression in peripheral blood of 100 cases of children with asthma(asthma group)and 30 healthy controls(control group)were determined by ELISA.And the result was analyzed statistically.ResultsContent of MIF in the peripheral blood in asthma group was significantly higher than that in control group (P﹤0.05),and MIF of catabatic period was also higher than that of control group，MIF in acute period was significantly higher than catabatic period (P﹤0.05).ConclusionMIF may involve the pathological physiology process of occurrence,development of bronchial asthma,and relates with its stage.

Child;Bronchial asthma;MIF;Enzyme linked immunosorbent assays

R562.2+5

B

1674-4721（2012）07（b）-0112-02

2012-04-18 本文編輯：魏玉坡）