陳 煥，耿冬平，李 科(第二軍醫(yī)大學藥學院藥物化學教研室，上海200433)

腫瘤特別是惡性腫瘤嚴重威脅人類健康。據世界衛(wèi)生組織調查，由惡性腫瘤引起的死亡每年約占所有疾病死亡人數的13%，并且呈逐年增長趨勢［1］。惡性腫瘤預后差、造成患者痛苦、治療費用高，不僅嚴重影響人們身心健康，而且給家庭、社會造成沉重經濟負擔，成為影響社會和諧發(fā)展的不容忽視的因素。臨床化學藥物治療是抗腫瘤的主要手段之一，因此，研發(fā)抗腫瘤藥物是國內外藥物研究的重要方向，也是我國“十一五”、“十二五”連續(xù)規(guī)劃的重點藥物研發(fā)領域。

從中藥中獲取有效成分，進而對其進行化學、藥理和臨床研究，是現代科技對中藥的巨大發(fā)展之一［2］。周大錚等從香榧假皮中提取分離得到了具有一定抗腫瘤活性的單體2－芳基－4－芐基四氫呋喃木脂素TG－10［3，4］(圖1)。為了獲取更高抗腫瘤活性的TG－10類衍生物，筆者對TG－10進行了結構改造和結構修飾，獲得了比較滿意的結果［5～7］。構效關系研究發(fā)現，TG－10的呋喃環(huán)非藥效必需基團且該環(huán)合成復雜。因此，筆者采用微波反應，經縮合、環(huán)化、水解及酰胺化等反應設計、合成了20個未見文獻報道的反式構型的N－取代苯基－2－(4－取代苯基)環(huán)丙烷－1－甲酸乙酯－1－酰胺系列化合物，目標化合物的結構通過1H NMR和MS確定。采用MTT法篩選體外抗腫瘤活性。實驗結果顯示，所合成的目標化合物具有較好的抗腫瘤活性。其中5b對A549細胞的IC50值達到6.8 μM，具有進一步研究的價值。微波反應實驗結果與文獻報道［8］相對比，在保證收率的同時，節(jié)約了原材料和防護了環(huán)境污染。合成路線見圖2。

圖1 TG-10的結構

圖2 目標化合物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器和材料 熔點由RY－2型熔點儀進行測定，溫度未經校正;核磁共振譜由Bruker AC－300P型儀器測定，TMS為內標，溶劑為DMSO;質譜由Finigan LCQ Deca XP MAX質譜儀測定;層析柱采用青島海洋化工廠生產的HSGF254型硅膠H(10～40 μM);所用試劑均為分析純試劑。

1.2 試劑干燥 無水CH2Cl2:CH2Cl2中加入CaH2(5 g/L)，回流5 h，蒸餾后分子篩(4?)保存;無水三乙胺:三乙胺中加入CaH2(5 g/L)，回流16 h，蒸餾后分子篩(4?)保存;無水 DMSO:DMSO中加入CaH2(5 g/L)，回流5 h，蒸餾后分子篩(4?)保存。

1.3 目標化合物的合成

1.3.1 4－氯苯基次甲基丙二酸二乙酯的制備 4－氯苯甲醛(14.57 g，0.1 mol)、丙二酸二乙酯(16.81 g，0.105 mol)、冰乙酸(3 ml，5.0 mmol)、哌啶(1.8 ml，3 mmol)、硅膠(1 g)依次加入干燥的甲苯(200 ml)中，攪拌回流反應12 h，分餾生成的水。減壓蒸去甲苯，殘留物用二氯甲烷(200 ml)和水(200 ml)分別萃取3次，合并有機相，減壓蒸去二氯甲烷，殘留固體用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)結晶。濾取結晶，真空干燥，得4－氯苯基次甲基丙二酸二乙酯。稱重得27.05 g(95.0 mmol)，收率95%。MP: 33.2～34.5℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 8.15(s，1H)，7.34(s，2H)，6.56(s，2H)，4.32～4.26(m，4H)，1.21～1.16(m，6H)。

1.3.2 4－三氟甲基苯基次甲基丙二酸二乙酯的制備 4－三氟甲基苯甲醛(18.81 g，0.1 mol)、丙二酸二乙酯(16.81 g，0.105 mol)、冰乙酸(3 ml，5.0 mmol)、哌啶(1.8 ml，3 mmol)、硅膠(1 g))依次加入干燥的甲苯(200 ml)中，攪拌回流反應12 h，分餾生成的水。減壓蒸去甲苯，殘留物用二氯甲烷(200 ml)和水(200 ml)分別萃取3次，合并有機相，減壓蒸去二氯甲烷，殘留固體用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)溶解，置冰箱中結晶。濾取結晶，真空干燥，得4－三氟甲基苯基次甲基丙二酸二乙酯。稱重得29.6 g(93.0 mmol)，收率93%。MP:51.3～52.5℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 8.35(s，1H)，7.65(s，2H)，7.43(s，2H)，4.39～4.34 (m，4H)，0.67～0.58(m，6H)。

1.3.3 2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1，1－二甲酸二乙酯的制備 NaH(2.38 g，99 mmol)加入到無水DMSO(200 ml)，攪拌溶解，分批加入三甲基碘化亞砜(21.78 g，99 mmol)，室溫攪拌至無氣體放出。加入4－氯苯基次甲基丙二酸二乙酯(25.6 g，90 mmol);于60℃、400 W微波反應器中反應10 min。反應結束后反應液用二氯甲烷(200 ml)和水(300 ml)各萃取3次，合并有機相，減壓蒸去二氯甲烷，殘留固體用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)重結晶。過濾晶體后干燥，得4－氯苯基環(huán)丙烷丙二酸二乙酯，稱重得25.37 g，收率95%。MP:77.7～78.5℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 7.37(s，2H)，6.54(s，2H)，4.34～4.30 (m，4H)，3.10～3.04(t，J=8.7 Hz，1H)，2.03～2.01(m，1H)，1.64～1.59(m，1H)，0.77～0.72 (m，6H)。

1.3.4 2－(4－三氟甲基苯基)環(huán)丙烷二甲酸二乙酯的制備 NaH(2.38 g，99 mmol)加入到無水DMSO(200 ml)，攪拌溶解，分批加入三甲基碘化亞砜(21.78 g，99 mmol)，室溫攪拌至無氣體放出。加入4－三氟甲基苯基次甲基丙二酸二乙酯(25.6 g，90 mmol);60℃、400 W微波反應器中反應10 min。反應結束后反應液用二氯甲烷(200 ml)和水(300 ml)各萃取3次，合并有機相，減壓蒸除溶劑。殘留物用乙酸乙酯∶石油醚=2∶1(v/v)重結晶。過濾晶體后干燥，得4－三氟甲基苯基環(huán)丙烷丙二酸二乙酯，稱重到27.65 g，收率93%。MP:125.5～126.1℃，1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 7.68(s，2H)，7.47(s，2H)，4.36～4.30 (m，4H)，3.23～3.18(t，J=8.4 Hz，1H)，2.16～2.12(m，1H)，1.71～1.66(m，1H)，0.76～0.71 (m，6H)。

1.3.5 2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1，1－二甲酸單乙酯的制備 2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1，1－二甲酸二乙酯(23.74 g，80 mmol)、乙醇∶水=10∶1(v/v)混合液(200 ml)和KOH(4.71 g，84 mmol)，于30℃攪拌反應3～4 h，然后先用3%HCl調pH至7，再加水至總溶液的2倍，靜置過夜，有大量白色固體析出，濾出固體，真空烘箱干燥，得2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1，1－二甲酸單乙酯，19.4 g，收率90%。MP:98.6～99.4℃。1H NMR (DMSO－d6，300 MHz):δ 12.02(s，1H)，7.39(s，2H)，6.57(s，2H)，4.32～4.28(m，2H)，3.11～3.07(t，J=8.7 Hz，1H)，2.23～2.19(m，1H)，1.60～1.56(m，1H)，0.76～0.73(m，3H)。

1.3.6 2－(4－三氟甲基苯基)環(huán)丙烷二甲酸單乙酯的制備 2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1，1－二甲酸二乙酯(26.40 g，80 mmol)、乙醇∶水=10∶1(v/v)混合液(200 ml)和KOH(4.71 g，84 mmol)，于30℃攪拌反應3～4 h，然后先用3%HCl調pH至7，再加水至總溶液的2倍，靜置過夜，有大量白色固體析出，濾出固體，真空烘箱干燥，得2－(4－三氟甲基苯基)環(huán)丙烷二甲酸單乙酯，21.5 g，收率87%。MP:134.8～136.1℃。1H NMR(DMSO－d6，300 MHz):δ 11.63(s，1H)，7.71(s，2H)，7.45(s，2H)，4.33～4.29(m，2H)，3.21～3.17(t，J=8.4 Hz，1H)，2.17～2.11(m，1H)，1.70～1.66(m，1H)，0.75～0.70(m，3H)。

1.3.7 (反式)N－苯基－2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺(5a)的制備 2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1，1－二甲酸單乙酯(1.34 g，5 mmol)、無水二氯甲烷(20 ml)和草酰氯(0.48 ml，5.05 mmol)，室溫攪拌反應6 h，反應結束后減壓蒸去反應液，得酰氯;苯胺(0.54 ml，6 mmol)溶于無水二氯甲烷(10 ml)中，再加入無水吡啶(1.05 ml，15 mmol)，冰浴冷至0℃，攪拌下滴入酰氯，滴畢保溫30 min后常溫反應過夜。先用3% HCl調pH至7.0，再用二氯甲烷和水萃取3次，合并有機相，用2%堿水洗滌3次，干燥后減壓蒸餾有機相，殘留物以乙酸乙酯:石油醚(v/v)為展開劑，經柱層析梯度洗脫(0%～3%;3%～6%;6%～10%)得到(反式)N－苯基－2－(4－氯苯基)環(huán)丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺。0.56 g，收率65%。

同法制得5b～5j，化合物的理化性質及譜圖數據見表1。

1.3.8 (反式)N－苯基－2－(4－三氟甲基苯基)環(huán)丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺(6a)的制備 2－(4－三氟甲基苯基)環(huán)丙烷二甲酸單乙酯(1.51 g，5 mmol)、無水二氯甲烷(20 ml)和草酰氯(0.48 ml，5.05 mmol)，室溫攪拌反應6 h，反應結束后減壓蒸去反應液，得酰氯;苯胺(0.54 ml，6 mmol)、無水二氯甲烷(10 ml)和無水吡啶(1.05 ml，15 mmol)，冰浴冷至0℃，攪拌下滴入酰氯，滴畢保溫30 min后常溫反應過夜。先用3%HCl調pH至7.0，合并有機相，用2%，干燥后減壓蒸餾有機相，殘留物以乙酸乙酯∶石油醚(v/v)為展開劑，經柱層析梯度洗脫(0%～3%;3%～6%;6%～10%)得到反式結構N－苯基－2－(4－三氟甲基苯基)環(huán)丙烷－1－甲酸乙酯－1－甲酰胺。0.70 g，收率74.1%。

所得目標化合物的純度經高效液相檢測，使用Agilent 1100 series LC system，柱子規(guī)格為4.6 mm ×150 mm，填充物為C8;流動相為甲醇∶水=7∶3 (v/v);流速為1.0 ml/min;每次進樣體20 μl;在254 nm紫外監(jiān)控。所有化合物的純度＞95%。

同法制得6b～6j，化合物的理化性質及譜圖數據見表1。

表1 目標化合物的理化性質及譜圖數據

Comp. Mp.(oC) Yield(%) Purity(%) MS(H+) 1H NMR(DMSO－d6/TMS，300 MHz，δ ppm) 6c 139.7～140.0 75.4 98.71 408.10 8.68(s，1H)，7.67～7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，7.56～7.48(m，4H)，6.90 (s，2H)，3.82～3.72(m，2H)，3.72(s，3H)，3.42～3.41(t，J=4.2 Hz，1H)，2.22～2.18(m，1H)，1.80～1.75(m，1H)，0.77～0.75(t，J=8.4 Hz，3H). 6d 138.2～139.5 76.2 98.52 412.05 9.46(s，1H)，8.76～8.72(t，J=6.0 Hz，1H)，7.65～7.62(d，J=7.8 Hz，2H)，7.46～7.44(d，J=7.8 Hz，2H)，7.35～7.31(m，1H)，7.18～7.12(t，J=9.0 Hz，2H)，4.37～4.33(m，2H)，3.21－3.19(t，J=8.7 Hz，1H)，2.15～2.11(m，1H)，1.71～1.67(m，1H)，0.71～0.67(t，J=6.9 Hz，3H). 6e 146.3～146.9 81.3 95.36 423.09 11.39(s，1H)，8.15(dd，J1=1.2 Hz，J2=1.2 Hz，1H)，7.78～7.73(t，J= 7.8 Hz，1H)，7.70～7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，7.54～7.52(d，J=8.1 Hz，2H)，7.38～7.34(m，2H)，3.84～3.75(m，2H)，3.30～3.29(t，J=1.2 Hz，1H)，2.37～3.32(m，1H)，2.01～1.97(m，1H)，0.73～0.68(t，J= 7.2 Hz，3H). 6f 146.3～146.9 82.0 95.72 428.09 8.82(s，1H)，7.65～7.63(d，J=8.4 Hz，2H)，7.47～7.44(d，J=8.1 Hz，2H)，7.41～7.32(m，4H)，3.80～3.69(m，2H)，3.24～3.18(t，J=8.4 Hz，1H)，2.16～2.11(m，1H)，1.71～1.66(m，1H)，0.73～0.71(t，J= 8.1 Hz，3H). 6g 102.1～102.3 78.4 95.47 414.09 8.87(s，1H)，7.47～7.39(m，2H)，7.33～7.30(t，J=8.4 Hz，2H)，7.25～7.22(d，J=8.4 Hz，2H)，7.12(dd，J1=4.8 Hz，J2=4.8 Hz，1H)，7.01 (dd，J1=5.1 Hz，J2=5.1 Hz，1H)，3.80～3.71(m，2H)，3.15～3.09(t，J =8.4 Hz，1H)，2.07(dd，J1=5.1 Hz，J2=5.7 Hz，1H)，1.67(dd，J1=4.8 Hz，J2=4.8 Hz，1H)，0.71～0.68(t，J=8.1 Hz，3H). 6h 71.6～71.9 65.9 97.52 392.12 8.77～8.73(t，J=6.0 Hz，1H)，7.65～7.62(d，J=8.4 Hz，2H)，7.47～7.44(d，J=8.4 Hz，2H)，7.36～7.21(m，5H)，4.39～4.35(m，2H)，3.76～3.70(m，2H)，3.24～3.18(t，J=8.4 Hz，1H)，2.16～2.11(m，1H)，1.71～1.66(m，1H)，0.72～1.67(t，J=7.2 Hz，3H). 6i 60.0～60.9 72.9 95.68 422.13 8.67(t，J=8.1 Hz，1H)，7.65(d，J=8.1 Hz，2H)，7.46～7.43(d，J=8.1 Hz，2H)，7.23～7.20(d，J=8.4 Hz，2H)，6.90～6.87(d，J=8.7 Hz，2H)，4.31～4.27(t，J=5.4 Hz，2H)，3.76～3.74(d，J=7.2 Hz，1H)，3.72(s，3H)，3.54～3.43(d，J=7.2 Hz，1H)，3.21～3.19(t，J=8.1 Hz，1H)，2.15～2.10(m，1H)，1.70～1.66(m，1H)，0.70～0.68(t，J=8.1 Hz，3H). 6j 74.2～74.6 74.5 96.51 406.14 8.72～8.68(t，J=6.0 Hz，1H)，7.65～7.62(d，J=8.1 Hz，2H)，7.46～7.43(d，J=8.1 Hz，2H)，7.19～7.17(d，J=8.1 Hz，2H)，7.14～7.11(d，J=8.1 Hz，2H)，4.39～4.25(m，2H)，3.78～3.67(m，2H)，3.23～3.17 (t，J=8.4 Hz，1H)，2.15～2.11(m，1H)，1.70～1.66(m，1H)，0.71～0.68(t，J=8.7 Hz，3H).

2 藥理實驗

2.1 材料與方法 測試細胞株:肺癌細胞(A549)，肝癌細胞(QGY)，宮頸癌細胞(HeLa)，結腸癌細胞(SW480)。陽性對照藥:TG－10。測試方法:采用MTT法進行體外抗腫瘤活性篩選。

2.2 藥理實驗操作

2.2.1 細胞培養(yǎng) 受試細胞在5%CO2、37℃條件下，用含10%小牛血清的DMEM溶液傳代培養(yǎng)，實驗所用細胞均處于對數生長期。

2.2.2 藥液制備 受試藥物分別用DMSO配成10 g/ L溶液，－20℃保存，實驗前，將藥液取出置室溫融化，并用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液溶解分別成80、40、20、10、5、2.5 μg/ml的藥液樣品，4℃冰箱保存。

2.3 實驗步驟

步驟1:取對數生長期細胞，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，制成單細胞懸液1×106個/ml，將該懸液加到96孔板中，每孔加入100 μl。

步驟2:在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取上清液，分別加入各濃度的受試藥物，設雙復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

步驟3:吸取上清液，加入20 μl MTT溶液(5 μg/ ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取上清液，加100 μl的DMSO，充分溶解后在570 nm處測定吸光值(OD值)，并按下列公式計算其抑制率。

步驟4:計算IC50，抑制率(%)=(對照孔OD值－實驗孔OD值)/對照孔OD值×100%，然后由SPSS軟件算出IC50值。

2.4 抗腫瘤實驗結果 見表2。

3 結果與討論

采用微波反應，經knoevenagel condensation縮合、環(huán)化、水解及酰胺化等反應設計、合成了20個未見文獻報道的反式構型的N－取代苯基－2－(4－取代苯基)環(huán)丙烷－1－甲酸乙酯－1－酰胺系列化合物，化合物的結構經1H NMR和LC－MS確證。合成中利用微波反應，比文獻報道［8］的合成方法在保持收率情況下，節(jié)省了原材料，降低了環(huán)境污染及提高了合成效率。體外抗腫瘤活性篩選實驗結果顯示:20個目標化合物對4種腫瘤細胞具有一定的抑制活性。其中，對A549非小細胞肺癌的抗腫瘤活性最好。對氯苯基取代系列化合物(5a～5j)比對三氟甲基苯基取代系列化合物(6a～6j)有更好的抗腫瘤活性(5h對A549、HeLa、QGY腫瘤細胞的IC50分別為18.3、24.6、56.2 μM，而6h相對應的腫瘤細胞活性IC50分別為46.2、36.1 μM和大于400 μM;芐胺取代比苯胺取代的活性較優(yōu)，5i對4種腫瘤細胞株的IC50分別為34.2、38.1、49.6、56.4 μM，相對比5c的IC50分別為53.5、89.9、167.5、90.5 μM;在酰胺芳香環(huán)上的不同取代基對抗腫瘤活性體現出一定的規(guī)律性:吸電子基團優(yōu)于供電子基團，化合物5b的化合物活性比5a活性較高，6b的化合物活性比6a較高。綜合所有的化合物抗腫瘤活性結果，化合物5b具有最好的活性，對A549、HeLa細胞的IC50分別達到了6.8、12.40 μM，優(yōu)于陽性對照藥TG－10(12.8、18.3 μM)。

表2 目標化合物體外抗腫瘤活性(IC50，μM)

筆者對TG－10進行了結構修飾，合成了20個全新的環(huán)丙烷酰胺類化合物，并進行了體外抗腫瘤活性篩選。腫瘤活性篩選結果表明，該類化合物具有一定的抗腫瘤活性，并具有一定的藥物構效關系。其中，化合物5b對A549、HeLa的活性優(yōu)于TG－10，取得了較好的效果。但由于所合成的化合物數量有限，尚未對該類化合物藥效關系進行更全面的研究。因此，有待我們對該類化合物進行更深層次的研究，建立環(huán)丙烷酰胺類化合物的數據庫，為該類化合物研究奠定基礎。

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