梁睿姝，張 川，鄒 豪，金 磊(.廣東雙林生物制藥有限公司，廣東湛江54009;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海00433)

山楂為薔薇科植物(Rosaceae)山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br，山楂 Crataegus pinnatifida Bge.及野山楂Crataegus cuneata Sieb et Zucc.的干燥成熟果實(shí)，又稱山楂果、山里紅、山梨、紅果等［1，2］。山楂的化學(xué)成分主要為有機(jī)酸類、酚酸類、三萜酸類、黃酮類［3］。綠原酸作為其中的主要成分之一，是衛(wèi)生部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)下重要的質(zhì)控指標(biāo)。

目前，綠原酸的含量測定方法主要有紫外可見分光光度法［4］、薄層色譜掃描法［5］、高效毛細(xì)管電泳法［6］、高效液相色譜法等［7］。在這些方法中，高效液相色譜法(HPLC)具有高效、準(zhǔn)確，受其他成分影響小的優(yōu)點(diǎn)。用高效液相色譜法對山楂活性成分分析的報(bào)道較多，但很多報(bào)道都是測定黃酮類成分，對山楂中綠原酸的分析報(bào)道較少［8，9］。本研究完成了通過方法學(xué)研究，建立綠原酸含量測定方法，證明該法具有準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)、快捷簡便等特點(diǎn)，可用于控制本品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 材料與儀器

1.1 材料 山楂(產(chǎn)自山東);甲醇(分析純，國藥集團(tuán)試劑公司);磷酸(分析純，國藥集團(tuán)試劑公司);甲醇(色譜純，美國J.T.Baker公司);水(娃哈哈純凈水);綠原酸(中國藥品生物制品檢定所，批號:117053-200413)。

1.2 儀器 DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);超越系列 XP205電子天平(METTLER TOLEDO);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210(瑞士BUCHI公司);e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);2489紫外分光光度計(jì)(美國Waters公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(25∶75);流速為1.0 ml/min;柱溫:28℃;檢測波長:327 nm;進(jìn)樣量:10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品7.03 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇定容，搖勻得濃度70.3 μg/ml母液，置－20℃冰箱保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取山楂樣品粗粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶瓶中，加入甲醇30 ml，密塞，稱定重量，加熱回流處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml蒸干，殘?jiān)铀? ml使其溶解，再加入氯仿5 ml萃取，浸漬3 min，離心，抽取上清液1ml，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，待測。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按2.1項(xiàng)的色譜條件下，以對照品溶液、樣品溶液分別進(jìn)樣，根據(jù)色譜參數(shù)計(jì)算系統(tǒng)適應(yīng)性。樣品中綠原酸保留時(shí)間是9.658 min，拖尾因子0.99，理論塔板數(shù)大于4 000，分離度為2.1。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1 綠原酸對照品(A)和供試品(B)HPLC色譜圖1-綠原酸

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得 7.03、14.06、21.09、28.12、42.18、56.24、70.3 μg/ml的溶液，分別進(jìn)樣10 μl，按上述色譜條件測定綠原酸峰面積，以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品濃度(μg/ ml)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=28 743X－46 672，r=0.999 6，綠原酸含量在7.03～70.3 μg/ml之間呈良好線性。

2.3.3 日內(nèi)精密度的考察 精密吸取7.03、28.12、70.3 μg/ml低、中、高3個(gè)濃度對照品，按上述液相色譜條件，1 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果綠原酸平均峰面積值分別為181 677.33、751 378.33、1 992 169.33，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.16%、0.27%和0.70%。

2.3.4 穩(wěn)定性的考察 精密稱取綠原酸供試品溶液，按上述液相色譜條件，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，結(jié)果供試品溶液中綠原酸在24 h內(nèi)峰面積無明顯變化，綠原酸峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.70%。

2.3.5 重現(xiàn)性考察 取山楂供試品適量5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，綠原酸平均含量為0.394 7 mg/g，RSD=3.14%。

2.3.6 回收率的測定 精密稱取0.25 g山楂樣品，向其中添加綠原酸對照品(70 μg/g)，按上述供試品溶液的制備項(xiàng)下進(jìn)行操作，測定計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.7 山楂含量測定 對3個(gè)不同批次的山楂按供試品溶液制備處理后，測定其含量。結(jié)果批號為110914、111008、111205的山楂中綠原酸平均含量分別為0.386 1、0.365 8、0.394 7 mg/g(n=3)。

3 討論

《中國藥典》一部中，山楂藥材只采用滴定法測定了枸櫞酸的含量。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過摸索供試品的制備方法及其適應(yīng)的色譜條件，采用HPLC法測定山楂中綠原酸的含量，而且取得較好的分離測定效果。

3.1 提取方法的研究 采用不同濃度(25%、50%、75%、100%)的甲醇對山楂中的綠原酸進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純甲醇的提取得率較高，故采用純甲醇提取綠原酸。加熱回流時(shí)間的考察中，分別考察了30、60、90、120 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30 min加熱回流已將綠原酸提取完全。

3.2 色譜條件的選擇 按相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法，分別以甲醇-磷酸二氫鈉、乙腈-磷酸等系統(tǒng)為流動(dòng)相進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在色譜條件:甲醇-0.1 M磷酸二氫鈉緩沖液(25∶75)，流速為1.0 ml/min時(shí)，250mm C18色譜柱，綠原酸的分離度為2.1，故采用以上的色譜條件。

［1］ 鄭虎占，董澤宏，佘 靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用:第一卷［M］.北京:學(xué)苑出版社，1997:597.

［2］ 馮鳳蓮，張卉朱.山楂的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，18(6):383.

［3］ 高光躍，馮毓秀，秦秀琴.山楂類果實(shí)的化學(xué)成分分析及其質(zhì)量評價(jià)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30(2):138.

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［6］ 張風(fēng)云，毛富春.用毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)測定杜仲葉中綠原酸含量的研究［J］.分析測試學(xué)報(bào)，1996，15(3):66.

［7］ 崔偉偉，范永春.不同提取方法測定野馬追藥材中綠原酸含量比較研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(3):178.

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