趙方振，莊春林，郭子照，盛春泉，姚建忠，繆震元，張萬年(第二軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室，上海200433)

p53蛋白是一種抑癌蛋白，它的失活與50% ～60%的癌癥發(fā)生密切相關(guān)。編碼的p53蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面均具有關(guān)鍵性作用，癌癥病人出現(xiàn)p53基因的功能缺失性突變，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)的主要原因。分子生物學(xué)研究表明細(xì)胞中存在的MDM2(murine double minute 2)蛋白是p53主要的負(fù)性調(diào)節(jié)子之一，p53能激活MDM2轉(zhuǎn)錄，MDM2反過來又能抑制p53活性，形成自動(dòng)調(diào)節(jié)反饋環(huán)，以保持正常情況下p53和MDM2都處于低水平狀態(tài)。而腫瘤細(xì)胞內(nèi)MDM2的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致p53因其泛素化而快速降解，從而影響p53對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制［1］。p53-MDM2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)闡明了p53與MDM2的作用模式，p53的關(guān)鍵性氨基酸Phe19、Trp23和Leu26插入MDM2的活性腔形成3個(gè)疏水性作用力，這一發(fā)現(xiàn)使得以p53-MDM2結(jié)合為靶標(biāo)的抗腫瘤藥物研究成為近年來抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)［2］。多肽及其類似物是最早發(fā)現(xiàn)的一類抑制劑，合成的八肽AP和天然產(chǎn)物環(huán)九肽chlorofusin都具有優(yōu)異的抑制活性，但由于肽類化合物的細(xì)胞滲透能力差致使體外腫瘤細(xì)胞活性并不理想［3，4］。近年來非肽類小分子p53-MDM2結(jié)合抑制劑成為該靶點(diǎn)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，國內(nèi)外研究者采用虛擬高通量篩選先后獲得多類全新結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑，其中順式咪唑啉類(nutlins)、螺吲哚滿酮類(spiro-oxindoles)、1， 4-苯并二氮-2，5-二酮類(benzodiazepinediones)三類研究最多，活性最好，目前已有3個(gè)化合物分別進(jìn)入I期臨床研究［5～7］。

筆者采用國外研究者相同的虛擬高通量篩選方法從商業(yè)化合物庫中篩選并驗(yàn)證了吡咯酮類化合物具有小分子p53-MDM2結(jié)合抑制作用，為進(jìn)一步進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，設(shè)計(jì)合成了5-取代苯基吡咯酮類化合物4a～4m，合成路線如圖1。

1 儀器與試劑

所用儀器為XT4A顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀、MAT-212型質(zhì)譜儀、Bruker-AC-P400型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))。柱色譜用硅膠H、薄層色譜用硅膠GF25均為青島海洋化工廠產(chǎn)品，所用試劑均為市售分析純。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線反應(yīng)條件:a-CH3OH，CH3ONa，70℃，3 h;b-subsitituted benzaldehyde，pyridin-3-ylmethanamine，dioxane，rt，24 h.

2 方法和結(jié)果

2.1 2-羥基-4-苯基-4-氧代-2-丁烯酸甲酯3的合成 在室溫下將29.2 g(0.2 mol)草酸二乙酯、12.0 g(0.1 mol)苯乙酮混合液緩慢滴加到2 mol/ L的甲醇鈉/甲醇溶液中，滴加完畢后升溫至70℃反應(yīng)3 h，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入2 L水中，過濾。濾液冰水浴下用濃鹽酸調(diào)pH至3～4，析出大量淡黃色固體，過濾，水洗，干燥得15.0 g淡黃色固體3，收率72.8%。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:14.83(s，1H)，8.06(d，2H，J=7.5 Hz)，7.70(t，1H，J=7.1 Hz)，7.57(d，2H，J =7.5 Hz)，7.11(s，1H)，3.85(s，3H)。ESIMS(m/z):207.29［M+1］+。

2.2 目標(biāo)化合物4a～4m的合成 將0.1 mol取代苯甲醛與1.1 g(0.1 mol)3-氨甲基吡啶加入到2 ml 1，4-二氧六環(huán)中，室溫?cái)嚢?0 min。然后將溶于2 ml 1，4-二氧六環(huán)的0.21 g(0.1 mol)化合物3緩慢滴入反應(yīng)液中，滴加完畢后繼續(xù)室溫反應(yīng)24 h。加入100 ml水，析出固體，過濾，得化合物4a～4m。

4-苯甲酰-5-(4-叔丁基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4a):白色固體，收率90.7%，mp 275～279℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:11.80(s，1H)，8.42(d，1H，J=3.8 Hz)，8.26(s，1H)，7.72(d，2H，J=7.3 Hz)，7.55(m，1H)，7.44(m，3H)，7.26(m，3H)，7.19(d，2H，J=8.2 Hz)，5.35(s，1H)，4.71(d，1H，J=15.5 Hz)，4.07(d，1H，J=15.5 Hz)，1.21(s，9H)。ESI-MS(m/z):426.28［M －1］－。

4-苯甲酰-5-(4-氟苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4b):白色固體，收率56.5%，mp 265～269℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:11.98(s，1H)，8.45(d，1H，J=4.7 Hz)，8.28(s，1H)，7.71(d，2H，J=8.4 Hz)，7.30～7.55(m，7H)，7.07(m，2H)，5.38(s，1H)，4.74(d，1H，J=5.5 Hz)，4.10(d，1H，J =15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):388.05［M －1］－。

4-苯甲酰-5-(4-溴苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4c):白色固體，收率66.9%，mp 262～264℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.11(s，1H)，8.45(d，1H，J=4.6 Hz)，8.30(s，1H)，7.70(d，2H，J=7.5 Hz)，7.41～7.54(m，5H)，7.30(m，3H)，5.35(s，1H)，4.76(d，1H，J=15.5 Hz)，4.08(d，1H，J =15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):451.65［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(4-氯苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4d):白色固體，收率61.9%，mp 262～264℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.10(s，1H)，8.45(d，1H，J=3.7 Hz)，8.29(s，1H)，7.70(d，2H，J=7.3 Hz)，7.30～7.56(m，4H)，7.28(m，5H)，5.37(s，1H)，4.76(d，1H，J=15.5 Hz)，4.09(d，1H，J =15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):403.77［M －1］－。

4-苯甲酰-5-(4-硝基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4e):黃色固體，收率69.9%，mp 260～263℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.30(s，1H)，8.43(d，1H，J=3.9 Hz)，8.29(s，1H)，8.09(d，2H，J=8.8 Hz)，7.70(d，2H，J=7.2 Hz)，7.51～7.58(m，4H)，7.26～7.43(m，3H)，5.53(s，1H)，4.74(d，1H，J=15.5 Hz)，4.18(d，1H，J=15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):387.84［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(1-萘基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4f):白色固體，收率71.4%，mp 266～270℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ: 11.85(s，1H)，8.43(d，1H，J=3.8 Hz)，8.29 (s，1H)，7.90(s，2H)，7.81(m，2H)，7.71(d，2H，J=7.5 Hz)，7.31～7.53(m，7H)，5.52(s，1H)，4.84(d，1H，J=15.5 Hz)，4.04(d，1H，J =15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):422.44［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(4-甲氧基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4g):白色固體，收率67.3%，mp 248～251℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:11.78(s，1H)，8.46(d，1H，J=4.7 Hz)，8.29(s，1H)，7.70(d，2H，J=8.2 Hz)，7.31～7.55(m，5H)，7.19(d，2H，J=8.6 Hz)，6.83(d，2H，J=8.6 Hz)，5.29(s，1H)，4.76(d，1H，J= 15.5 Hz)，3.99(d，1H，J=15.5 Hz)，3.33(s，3H)。ESI-MS(m/z):401.72［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(4-三氟甲基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4h):白色固體，收率82.2%，mp 265～269℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.10(s，1H)，8.42(m，1H)，8.29 (s，1H)，7.70(d，2H，J=8.4 Hz)，7.60(d，2H，J=8.2 Hz)，7.48～7.54(m，4H)，7.41～7.44(m，3H)，5.49(s，1H)，4.73(d，1H，J= 15.5 Hz)，4.15(d，1H，J=15.5 Hz)。ESI-MS (m/z):439.63［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(2，4-二甲基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4i):白色固體，收率72.9%，mp 227～230℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:11.85(s，1H)，8.45(d，1H，J=4.7 Hz)，8.26(s，1H)，7.69(d，2H，J=8.4 Hz)，7.33～7.54(m，5H)，6.92(m，3H)，5.51(s，1H)，4.83(d，1H，J=15.5 Hz)，3.80(d，1H，J =15.5 Hz)，2.18(s，3H)，2.15(s，3H)。ESIMS(m/z):399.73［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(2，4-二氯苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4j):白色固體，收率25.1%，mp 228～232℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.30(s，1H)，8.45(d，1H，J=4.2 Hz)，8.32(s，1H)，7.73(d，2H，J=7.7 Hz)，7.42～7.56(m，5H)，7.24～7.34(m，3H)，5.82(s，1H)，4.73(d，1H，J=15.5 Hz)，4.11(d，1H，J= 15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):440.14［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(3，5-二甲基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4k):白色固體，收率70.4%，mp 241～243℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:11.90(s，1H)，8.45(d，1H，J=4.7 Hz)，8.28(s，1H)，7.68(d，2H，J=8.4 Hz)，7.31～7.55(m，5H)，6.85(m，3H)，5.26(s，1H)，4.74 (d，1H，J=15.5 Hz)，4.03(d，1H，J=15.5 Hz)， 2.18(s，6H)。ESI-MS(m/z):399.73［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(3-羥基苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4l):淡黃色固體，收率51.8%，mp 266～268℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.10(s，1H)，9.42(s，1H)，8.42(m，1H)，8.30(s，1H)，7.69(d，2H，J=7.1 Hz)，7.31～7.55(m，6H)，7.41～7.44(m，3H)，5.23(s，1H)，4.80(d，1H，J=15.5 Hz)，3.96(d，1H，J= 5.5 Hz)。ESI-MS(m/z):387.84［M+1］+。

4-苯甲酰-5-(2-溴苯基)-3-羥基-1-(3-吡啶甲基)-1H-吡咯-2(5H)-酮(4m):白色固體，收率33.4%，mp 227～228℃，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ:12.11(s，1H)，8.43(d，1H，J=4.7 Hz)，8.31(s，1H)，7.73(d，2H，J=7.3 Hz)，7.43～7.57(m，5H)，7.15～7.30(m，3H)，5.88(s，1H)，4.75(d，1H，J=15.5 Hz)，4.09(d，1H，J= 15.5 Hz)。ESI-MS(m/z):451.65［M+1］+。

3 p53-MDM2蛋白結(jié)合抑制活性

參考國外文獻(xiàn)［5，6］，采用熒光偏振法測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)p53-MDM2蛋白結(jié)合抑制常數(shù)，以陽性對(duì)照藥nutlin-3a(Sigma公司)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)p53-MDM2蛋白結(jié)合抑制活性

4 討論

從表1中可以看出，所有的目標(biāo)化合物對(duì)p53-MDM2蛋白結(jié)合均有明顯抑制活性，其中5個(gè)化合物的抑制常數(shù)Ki在1 μM以下，化合物4b和4e的抑制常數(shù)分別達(dá)到了0.156和0.051 μM，優(yōu)于陽性對(duì)照藥nutlin-3a的0.230 μM。分析目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系發(fā)現(xiàn)，5位苯環(huán)上取代基團(tuán)對(duì)活性影響很大，吸電子基團(tuán)取代化合物活性優(yōu)于供電子基團(tuán)取代化合物，其中苯環(huán)對(duì)位硝基取代化合物4e活性最強(qiáng)，達(dá)到了陽性對(duì)照藥nutlin-3a的5倍以上。當(dāng)苯環(huán)上有多取代基團(tuán)時(shí)也顯示出相同的構(gòu)效關(guān)系，二氯取代化合物4j活性明顯高于二甲基取代化合物4i和4k。

綜上所述，本合成通過吡咯酮5位苯環(huán)上取代基團(tuán)對(duì)活性影響的研究，從中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)活性高于陽性對(duì)照藥5倍以上的衍生物4e，值得進(jìn)一步深入研究其體內(nèi)外抗腫瘤活性。

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［2］ Kussie PH，Gorina S，Marechal V，et al.Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain［J］.Science，1996，274:948.

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