張明，鄭鳳娥，楊春暉

（國家加工食品及添加劑質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，遼寧沈陽110136）

在我國乳品工業(yè)中，人們廣泛采用抗生素來治療奶牛的乳腺炎和其它感染性疾病，這導致我國乳制品中抗生素含量較高。2001年9月，我國農(nóng)業(yè)部頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標準，該標準規(guī)定生鮮乳中抗生素“不得檢出”。為了防止抗生素在乳制品中的殘留，不法生產(chǎn)者在牛奶中加入生物解抗劑，這種解抗劑就是從微生物中提取的β-內(nèi)酰胺酶。該酶能催化水解6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）及其N-酰基衍生物分子中β-內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵，其對青霉素具有破壞或抑制作用[1-3]。經(jīng)生物解抗劑處理過的牛奶存在以下潛在危害：①降解產(chǎn)物是抗生素的類似物，人長期飲用會引起耐藥性；②解抗劑濫用會引入大量的致病菌、致癌物等有害物質(zhì)，危害人民身體健康。③產(chǎn)品以次充好，擾亂市場。本研究通過舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的這種作用，在樣品中先后加入舒巴坦和青霉素，采用杯碟法測定抑菌圈大小差異來檢測β-內(nèi)酰胺酶。然后對菌種、培養(yǎng)基、所選用試劑濃度和培養(yǎng)時間等方面進行研究，確定了檢測方法條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

藤黃微球菌（Micrococcus Luteus），菌種號CMCC（B）28001，中國藥品生物制品檢定所。

抗生素Ⅰ號培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，磷酸氫二鉀3 g，牛肉粉3 g，瓊脂13 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～6.6。

菌種培養(yǎng)基（LB 營養(yǎng)瓊脂）：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15 g～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要試劑和儀器

β-內(nèi)酰胺酶標準品：純度≥90%，酶活1 200 IU/mg，中國藥品生物制品檢定所；舒巴坦標準品：純度89.2 %，中國藥品生物制品檢定所；青霉素G：色譜級，純度97%，中國藥品生物制品檢定所。

恒溫培養(yǎng)箱（DHP9082）：上海一恒科技有限公司；抑菌圈自動測量分析儀（ZY-300IV）：北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司；培養(yǎng)皿：內(nèi)徑（90±0.5）mm，皿底平整光滑，厚薄均勻無凹凸現(xiàn)象；血球計數(shù)板；牛津杯：不銹鋼管，外徑[（7.8±0.1）mm]，內(nèi)徑[（6.0±0.1）mm]，高度[（10.0±0.1）mm]；陶瓦蓋：內(nèi)徑110 mm，外徑116 mm，高度26 mm。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

取新鮮培養(yǎng)的藤黃微球菌LB 營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，每只管中加入2 mL～3 mL 滅菌生理鹽水，將菌苔洗下，振蕩均勻，合并菌液至滅菌試管中。

1.2.2 檢定用培養(yǎng)基的制備

在無菌培養(yǎng)皿中注入抗生素Ⅰ號培養(yǎng)基，作為底層培養(yǎng)基，水平靜置，使其凝固。將適量菌懸液加入到55 ℃左右的菌種培養(yǎng)基中，混勻，然后注入鋪有底層培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，均勻攤開、凝固。在每個培養(yǎng)基表面放置4 個牛津杯，呈均勻?qū)ΨQ分布。檢定用培養(yǎng)基平板需當天配置使用。

1.2.3 試樣制備

樣品：將25 mL 樣品混合均勻，待處理。陰性對照樣品：0.8%滅菌生理鹽水。陽性對照樣品：酶活力為0.1 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的陽性對照樣品。將試樣和對照品分別加入適量舒巴坦和青霉素G，將上述混合液充分振蕩混勻，室溫放置1 h。

1.2.4 試樣測定

每組試驗做3 個重復，將陶瓦蓋蓋好，培養(yǎng)皿水平放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h～24 h。培養(yǎng)結(jié)束后去除陶瓦蓋和牛津杯，使用抑菌圈自動測量分析儀或游標卡尺精確測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 指示菌和菌懸液

2.1.1 指示菌的選擇

因為β-內(nèi)酰胺酶的檢測是以青霉素作為直接檢測指標進行的測定，所以選擇非致病性的對青霉素敏感的藤黃微球菌作為指示菌[4]。

2.1.2 菌懸液濃度的確定

本研究使用0.8%滅菌生理鹽水3 mL 將新鮮培養(yǎng)的藤黃微球菌洗滌下來制成菌懸液[5]，使用血球計數(shù)板對其計數(shù)，得出菌懸液濃度為1×109cfu/mL。

2.2 培養(yǎng)基的選擇及用量

2.2.1 培養(yǎng)基的選擇

下層培養(yǎng)基根據(jù)藥典采用抗生素Ⅰ號培養(yǎng)基，用量為10 mL。

上層培養(yǎng)基分別考察了抗生素Ⅳ號培養(yǎng)基和LB營養(yǎng)瓊脂[6]按照本方法進行操作，兩種培養(yǎng)基的實驗結(jié)果見圖1。

從實驗結(jié)果可以看出藤黃微球菌在抗生素Ⅳ號培養(yǎng)基上不能良好地生長，而在LB 營養(yǎng)瓊脂上生長良好，青霉素可以抑制藤黃微球菌在LB 營養(yǎng)瓊脂上的生長。因此選擇LB 營養(yǎng)瓊脂作為上層培養(yǎng)基使用。

2.2.2 上層培養(yǎng)基的用量

為考察上層培養(yǎng)基用量對實驗結(jié)果的影響，我們做了如下實驗：固定下層培養(yǎng)基用量為10 mL，上層培養(yǎng)基（含1×109cfu/mL 藤黃微球菌）用量分別為4 mL、5 mL、6 mL。配制一定濃度青霉素G 的生理鹽水標液，按照本方法進行操作。實驗結(jié)果見表1。4 mL 上層培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑為26.54 mm；5 mL 上層培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑為24.16 mm；6 mL 上層培養(yǎng)基產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑為23.53 mm。從實驗數(shù)據(jù)中可以看出，上層培養(yǎng)基的用量越少，溶液滲透后所形成的抑菌圈越大。但考慮到雙層平板在制備的過程中對上層培養(yǎng)基溫度、培養(yǎng)基的水平程度的要求，選擇5 mL 最為適宜。

表1 上層培養(yǎng)基用量對實驗結(jié)果的影響Table 1 The effects of upper medium volume on the experimental results

2.3 青霉素G 濃度的選擇

3 個抗生素檢測平板，每個平板上放置3 個牛津杯，杯中分別加入200 μL 含有0.05 μg/mL，0.1 μg/mL，0.2 μg/mL，0.5 μg/mL，1.0 μg/mL，1.5 μg/mL，3.0 μg/mL，6.0 μg/mL，12 μg/mL 青霉素G 的10%脫脂牛奶，37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h。實驗結(jié)果見表2。

表2 不同濃度青霉素的抑菌圈實驗Table 2 The inhibition zone test of different concentrations of penicillin

在杯碟法試驗中，產(chǎn)生的抑菌圈越大，誤差就越大。一般選擇抑菌圈大小在24 mm 左右較為適宜。0.5 μg/mL 的青霉素G 在抗生素檢定平板上可產(chǎn)生穩(wěn)定的24 mm 的抑菌圈直徑，為了使結(jié)果更便于觀察，我們選擇0.5 μg/mL 的青霉素G 作為使用濃度。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶對抑菌效果的影響

2.4.1 β-內(nèi)酰胺酶對藤黃微球菌生長的影響

在每個抗生素檢測用培養(yǎng)基上均勻放置6 個牛津杯，在每個杯子中分別加入200 μL 不同濃度β-內(nèi)酰胺酶（0.001 IU/mL，0.1 IU/mL，1 IU/mL，10 IU /mL，100 IU/mL，1000 IU/mL） 的標準溶液，37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h，觀察牛津杯周圍的抑菌圈情況。實驗結(jié)果見圖2。

從實驗結(jié)果可以看出，各種濃度的β-內(nèi)酰胺酶均沒有形成抑菌圈，說明在選擇的濃度范圍內(nèi)β-內(nèi)酰胺酶對藤黃微球菌的生長沒有影響。

2.4.2 β-內(nèi)酰胺酶對青霉素抑菌效果的影響

配制含有不同濃度單位為IU/mL 的β-內(nèi)酰胺酶（0、5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、0.05、0.5、5）的奶樣，在奶樣中加入青霉素G，使終濃度為0.5 μg/mL。

在每個抗生素檢測用培養(yǎng)基上均勻放置4 個牛津杯，在每個杯子中分別加入200 μL 上述樣液37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h，觀察抑菌圈情況。實驗結(jié)果見表3。

表3 β-內(nèi)酰胺酶對青霉素抑菌作用的影響Table 3 The inhibitory effects of β-lactamase on penicillin

從實驗結(jié)果可以看出濃度在0.05 IU/mL 及以上的β-內(nèi)酰胺酶可以將0.5 μg/mL 青霉素G 完全分解，使其失去抑菌作用。

2.5 舒巴坦用量的確定

2.5.1 舒巴坦抑菌濃度的確定

配制含有不同濃度舒巴坦（0、12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL）的奶樣。

在每個抗生素檢測用培養(yǎng)基上均勻放置4 個牛津杯，在每個杯中分別加入200 μL 以上不同舒巴坦?jié)舛鹊哪虡?7 ℃培養(yǎng)18 h～22 h。觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，以確定不產(chǎn)生抑菌圈的最高舒巴坦?jié)舛?。實驗結(jié)果見表4。

表4 舒巴坦抑菌濃度實驗結(jié)果Table 4 The results of sulbactam MIC

從試驗結(jié)果中可以看出，舒巴坦?jié)舛仍?00 μg/mL以下均不產(chǎn)生抑菌圈，表明200 μg/mL 的舒巴坦?jié)舛仁强刂瓶股氐呐R界濃度，因此可以確定舒巴坦的安全使用濃度范圍為0～200 μg/mL。為了更安全起見，選取0～100 μg/mL 濃度的舒巴坦通過以下試驗確定最佳使用濃度。

2.5.2 舒巴坦使用濃度的確定

牛奶解抗劑的推薦使用濃度為4 mL，牛奶解抗劑加入到4 t 牛奶中。本實驗將解抗劑加到10%空白牛奶中，稀釋配成牛奶解抗劑濃度為10-4的奶樣（高于推薦使用濃度100 倍），用來確定舒巴坦的使用濃度。

2 個抗生素檢測平板，每個平板上平均放置3 個牛津杯，在2 個檢測平板的1 個牛津杯中均加200 μL含有0.5 μg/mL 青霉素的空白奶樣；其余4 個杯子杯子中分別添加200 μL 含有0.5 μg/mL 青霉素G、舒巴坦（25，50，75，100 μg/mL）的解抗劑濃度為10-4的奶樣，37 ℃培養(yǎng)18 h～22 h。觀察產(chǎn)生抑菌圈情況，以確定舒巴坦最終適用濃度。結(jié)果見表5。

表5 確定舒巴坦使用濃度試驗數(shù)據(jù)Table 5 The experimental data of the concentration of sulbactam using

由試驗結(jié)果可以看出，添加舒巴坦?jié)舛葹?5 μg/mL時，抑菌圈直徑為16.99 mm，當添加舒巴坦?jié)舛葹?0、75、100 μg/mL 時，抑 菌 圈 直 徑 分 別 達 到25.01，25.08，25.09 mm，與僅添加青霉素形成的抑菌圈直徑25.05 mm 相差很小。即當舒巴坦的濃度為25 μg/mL未能完全抑制牛奶解抗劑的活性；舒巴坦超過50 μg/mL時，高濃度牛奶解抗劑的活性均能被抑制，因此，選擇舒巴坦的使用濃度為50 μg/mL，這一濃度與200 g/mL的舒巴坦最高安全使用濃度相差4 倍。

2.6 方法檢測限

準確配置含有0.02、0.01、0.005、0.001 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的牛奶樣液，按樣品檢測進行操作，測定牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測限，試驗結(jié)果見表6。實驗結(jié)果表明，本方法的最低檢測限為0.005 IU/mL。

2.7 培養(yǎng)時間的確定

配制含β-內(nèi)酰胺酶0.005 IU/mL 的10%脫脂奶，做定性試驗，共需15 個平行，在培養(yǎng)到18、20、22、24、26 h 時分別取出3 個平皿，測量A、D 圈的大小變化。結(jié)果見表7。

表6 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶檢測限實驗數(shù)據(jù)Table 6 The experimental data of β-lactamase detection limit in milk

表7 β-內(nèi)酰胺酶（0.005 IU/mL）培養(yǎng)時間試驗數(shù)據(jù)Table 7 The test data of incubation time with 0.005 IU/mL β-lactamases

由試驗結(jié)果可知，當培養(yǎng)時間在22 h～24 h 時，A與D 抑菌圈直徑之差趨于穩(wěn)定，所以確定培養(yǎng)時間為22 h～24 h。

2.8 方法的準確度試驗

準確配置含有0.005 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的牛奶標準溶液，使用該方法進行9 次3 組平行測定，考察方法的準確性，試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表8。

表8 β-內(nèi)酰胺酶（0.005 IU/mL）檢測準確度試驗Table 8 The detection accuracy for β-lactamases（0.005 IU/mL，0.01 IU/mL）

由試驗結(jié)果可知，0.005 IU/mL 3 組平行9 次測定結(jié)果重復性較好，方法準確性較高。

3.9 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的溫度穩(wěn)定性試驗

配含β-內(nèi)酰胺酶0.005 IU/mL 的奶樣，配好后分裝到10 mL 離心管中，分別放在－18 ℃～－20 ℃、25 ℃和4 ℃下保藏，分別在1、2、4、8、12 和16 d 進行定性測定，考察不同溫度下樣品的穩(wěn)定性，試驗結(jié)果見表9。

由數(shù)據(jù)可以看出，在本試驗所選的溫度條件下（－18 ℃～－20 ℃；25 ℃；4 ℃），含0.005 IU/mL β-內(nèi)酰胺酶的奶樣，可以檢出β-內(nèi)酰胺酶，表明含有的β-內(nèi)酰胺酶牛奶在－18 ℃、－20 ℃、25 ℃和4 ℃的保存條件下，β-內(nèi)酰胺酶受溫度的影響較小。從實驗結(jié)果中可以看出隨著保存時間的延長，酶活力逐漸下降，但在16 d時0.005 IU/mL 依然能檢出。

表9 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性試驗Table 9 The stability test of β-lactamase in milk

3 結(jié)論

通過杯碟法對液體乳和乳飲料中β-內(nèi)酰胺酶進行檢測，確定了杯碟法檢測液體乳和乳飲料中β-內(nèi)酰胺酶的各項參數(shù)。選擇藤黃微球菌作為指示菌，菌懸液濃度要求達到1×109cfu/mL，上層培養(yǎng)基使用LB 營養(yǎng)瓊脂，用量為5mL，青霉素G 的使用濃度為0.5 μg/mL，β-內(nèi)酰胺酶對藤黃微球菌的生長沒有影響，0.05 IU/mL的β-內(nèi)酰胺酶可以將0.5 μg/mL 青霉素G 完全分解，舒巴坦的使用濃度為50 μg/mL。本方法中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢測限為0.005 IU/mL；最佳培養(yǎng)時間為22 h～24 h，測定結(jié)果的重復性好，方法準確性高。溫度試驗證明牛奶中存在的β-內(nèi)酰胺酶在－18 ℃～－20 ℃、25 ℃和4 ℃3 種溫度條件下，酶活力變化沒有明顯的區(qū)別。但是無論在那種溫度條件下，隨著時間的延長，酶活力逐漸下降，0.005 IU/mL 的β-內(nèi)酰胺酶在3 種溫度條件下16 d 依然能檢出酶活性。本方法的研究可用于監(jiān)測和檢測目前我國乳制品中使用β-內(nèi)酰胺酶的情況，為乳制品檢測提供技術(shù)支持，為國家標準的起草提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)，可用于政府部門的監(jiān)督檢驗，也可用于企業(yè)自檢自查。

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