肖志堅(jiān)，紀(jì) 艷，劉德江，吳恒梅，羅志文

（佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

菊花（Chrysanthemum）原產(chǎn)中國(guó)，為菊科（Asteraceae）菊屬（Chrysanthemum）的多年生宿根草本植物，是世界著名的四大切花之一，具有極高的觀賞價(jià)值。菊花品種繁多，花色各異，是公園花展和家庭裝飾的主要花卉。目前菊花的繁殖一般采用扦插、分株等傳統(tǒng)方法，以及組織培養(yǎng)、離體快繁、工廠化生產(chǎn)等高新技術(shù)，可在短時(shí)期內(nèi)獲得大量菊花種苗。筆者以菊花為材料，從培養(yǎng)基的制備，菊花外植體的選擇、滅菌和接種等方面探討了菊花的組織培養(yǎng)技術(shù)，以期為菊花在園藝植物工廠化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

選取無病毒、無病害、生長(zhǎng)良好的菊花作為組織培養(yǎng)的材料，并準(zhǔn)備制備MS培養(yǎng)基所需的試劑，如乙醇、1 mol/L 的 HCl、1 mol/L 的 NaOH、升汞、瓊脂、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸(NAA)及蔗糖等。

1.2 設(shè)施與設(shè)備

菊花組織培養(yǎng)所需的設(shè)施有：培養(yǎng)基制備、滅菌和材料處理室、無菌接種室、組織培養(yǎng)室、種苗移栽培養(yǎng)室、培養(yǎng)架、花木栽培室（棚、陰棚、苗圃）。

菊花組織培養(yǎng)所需的設(shè)備儀器有：超凈工作臺(tái)或簡(jiǎn)易接種箱、高壓滅菌鍋、解剖刀、鑷子、容量瓶、錐形瓶、培養(yǎng)皿、燒杯、封口膜、白線繩、牛皮紙、圓濾紙、解剖剪、天平。

2 最佳培養(yǎng)基的篩選

從多次的對(duì)比試驗(yàn)中篩選出下列培養(yǎng)基。

叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

叢生芽繼代最佳培養(yǎng)基：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

最佳生根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.1 mg/L NAA

3 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基配制過程為：

3.1 MS培養(yǎng)基母液的配制與保存

MS培養(yǎng)基母液包括：儲(chǔ)備液I（大量元素母液）、儲(chǔ)備液II（微量元素母液）、儲(chǔ)備液III（有機(jī)成分母液）、儲(chǔ)備液IV（鐵鹽母液）及植物激素母液（NAA母液和6-BA母液）。

儲(chǔ)備液I～I(xiàn)II的配制方法為：按照表1的配方將每種試劑先分別溶解，再彼此混合，最后定溶至所需數(shù)量。儲(chǔ)備液IV的配制方法為：取FeSO4·7H2O5 566 mg和 Na2EDTA·2H2O 7 460 mg分別置于450 mL蒸餾水中，加熱攪拌使之溶解，然后將2種溶液混合，再加蒸餾水至1L。

表1 儲(chǔ)備液I～I(xiàn)II的配方

植物激素母液的配制方法為：①0.1 mg/L NAA母液。稱取10 mgNAA，用少量95%乙醇或少量乙酸溶解后，用蒸餾水定溶至100 mL。②10 mg/L 6-BA母液。稱取100 mg 6-BA，用少量1 mol/mL的鹽酸溶解后，用蒸餾水定溶至100 mL。然后根據(jù)所需功能的不同，在MS培養(yǎng)基中加入不同量的NAA和6-BA母液，具體加入量見表2。

最后，將配制的所有母液放入冰箱保存，特別應(yīng)注意將儲(chǔ)備液IV儲(chǔ)存于棕色瓶中。

表2 各功能培養(yǎng)基中植物激素母液加入量 mL

3.2 培養(yǎng)基的配制與分裝

1 L培養(yǎng)基的配制：分別取50 mL儲(chǔ)備液I，5 mL儲(chǔ)備液II，5 mL儲(chǔ)備液III和5 mL儲(chǔ)備液IV，1 mL NAA母液，2 mL 6-BA母液放入1 000 mL的燒杯中；另取1個(gè)燒杯（或不銹鋼鍋）加入700 mL蒸餾水、30 g蔗糖、7 g瓊脂，加熱使瓊脂溶化，再將溶解的瓊脂糖溶液倒入盛有各種母液的燒杯中，用蒸餾水定溶至1 L，混勻后測(cè)pH；用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.8，最后將培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中。

誘導(dǎo)叢生芽和繼代培養(yǎng)，取50 mL的錐形瓶，每瓶注入20 mL培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)取100 mL錐形瓶，每瓶注入30 mL培養(yǎng)基；分裝后用封口膜和線繩封口。

3.3 滅菌

待滅菌的物品有：培養(yǎng)基、無菌水和裝有濾紙的培養(yǎng)皿。

具體滅菌步驟是：先將蒸餾水裝入1 000 mL錐形瓶的3/4處，用封口膜和牛皮紙兩層封口；再將裝有濾紙的培養(yǎng)皿5個(gè)一包；然后，連同已分裝好的培養(yǎng)基一起放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在1.2個(gè)大氣壓下滅菌10～15 min，冷卻后備用。注意滅菌時(shí)間不得超過15 min，以免培養(yǎng)基變性。

4 菊花的組織培養(yǎng)技術(shù)

4.1 組培部位的選擇

菊花可再生植株的器官有很多，如莖尖、莖段、側(cè)芽、葉、花序軸、花瓣等。若以快速繁殖為目的，應(yīng)采用莖尖和側(cè)芽，其次是花序軸；若以育種為目的，則應(yīng)采用花瓣；若以脫毒為目的，則必須用莖尖。

菊花的初代培養(yǎng)最好在9月進(jìn)行。以花序軸為材料時(shí)，應(yīng)選取具備該品種典型特征的飽滿壯實(shí)的花蕾，最好是含苞待放的花蕾（內(nèi)部無菌）。采摘后應(yīng)做好表面滅菌，以便于無菌條件下剝離出花序軸，進(jìn)而用于接種。

4.2 組培材料的滅菌

取開花前2～3 d將要開放的菊花花蕾，放入燒杯中，先用自來水沖洗10 min；然后在已滅菌的超凈臺(tái)上，用75%的乙醇浸泡30 s后，用無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞消毒10 min，用無菌水沖洗4～5次；最后放入已滅菌有濾紙的培養(yǎng)皿中，在無菌的條件下，進(jìn)行剝離和接種。

4.3 接種

無菌接種前，應(yīng)對(duì)無菌室進(jìn)行全面消毒，包括超凈臺(tái)的滅菌及手的消毒（75%酒精棉消毒）。無菌接種過程應(yīng)在酒精燈控制下進(jìn)行。

具體接種步驟為：花蕾在培養(yǎng)皿中被濾紙吸干后，剝除花序軸外層花被，得到半球形的花序軸，把花序軸切成4塊，每個(gè)錐形瓶放入2塊，正面向上，封口后送進(jìn)組培室。培養(yǎng)室的溫度應(yīng)保持在24～26℃，相對(duì)濕度應(yīng)保持在60%～70%，每天應(yīng)保證12 h的光照，光照強(qiáng)度約為1 500 Lx，也可使用自然光。3 d后外植體膨大，12 d后分化出芽，30 d后芽分化基本停止，當(dāng)芽苗達(dá)2 cm時(shí)即可轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

4.4 繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)4～5周為1次，增殖倍率均在5～10倍以上，繼代次數(shù)在10次左右芽苗均較理想。繼代5次后，選取一部分芽苗進(jìn)行生根培養(yǎng)和移植栽培，另一部分芽苗繼續(xù)繼代增殖。

通過調(diào)整6-BA濃度控制芽苗的增殖倍率，前幾次繼代時(shí)，6-BA濃度可以高一些；接近選用芽苗生根時(shí)，6-BA的濃度可以低一些，使芽苗的增殖倍率下降，生長(zhǎng)健壯，以利于生根和移栽。6-BA的添加范圍為0.1～1.5 mg/L。

轉(zhuǎn)接方法為：在無菌條件下，使用2個(gè)50 mL錐形瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)接，用酒精燈控制瓶口，防止雜菌進(jìn)入瓶中造成污染；將具有芽苗的錐形瓶打開，用解剖刀或剪刀切取1株芽苗接種至裝有新培養(yǎng)基的錐形瓶中，每瓶接芽苗1株，封口后移至培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件與誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)相同，光照強(qiáng)度可以提高一些。

4.5 生根與移栽

在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，芽苗達(dá)3 cm時(shí)，將單株嫩芽切下，插入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生根培養(yǎng)使用100 mL的錐形瓶，以利于培養(yǎng)大苗壯苗。生根培養(yǎng)基中不加6-BA，因?yàn)?-BA利于生芽，NAA利于生根。一般培養(yǎng)2周，即可生根；生根培養(yǎng)4周，根長(zhǎng)＞1 cm時(shí)，出瓶移栽。

移栽前，將芽苗生根的錐形瓶移至種苗移栽培養(yǎng)室內(nèi)煉苗6 d，前3 d將瓶口打開一半，后3 d將瓶口完全打開，以使芽苗逐步適應(yīng)培養(yǎng)室環(huán)境。另外，應(yīng)準(zhǔn)備培養(yǎng)箱和基質(zhì)，培養(yǎng)箱長(zhǎng)55 cm，寬37 cm，栽植的株行距為4 cm×6 cm；基質(zhì)的成分為田園土、沙、腐葉及腐熟的豬糞，比例為5︰2︰2︰1，并經(jīng)暴曬消毒；培養(yǎng)室溫度控制在24～26℃，相對(duì)濕度控制在80%左右，適當(dāng)遮陽。

移栽時(shí)，用鑷子將小苗輕輕取出，在清水中將依附于小苗根部的培養(yǎng)基洗凈，輕輕栽于培養(yǎng)箱的基質(zhì)中；使用小型營(yíng)養(yǎng)缽，每缽1株，栽后放置于架上培養(yǎng)；栽后開始階段覆膜保濕；移栽7 d后，芽苗即可成活；當(dāng)苗長(zhǎng)到一定大小時(shí)，根據(jù)生產(chǎn)目的移至棚、室或花圃進(jìn)行栽培管理。

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