李克雄 高崇凱

桑葉藥材水浸出物和指標成份的含量測定研究

李克雄 高崇凱

目的 研究桑葉藥材的質量，通過藥材提取物（流膏、干膏和浸出物）和指標成份含量的測定以及藥材的薄層鑒別，從定量角度來研究藥材質量。方法 主要采用高效液相色譜法，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-乙腈-醋酸-水（15:10:2.6:72.4）為流動相，檢測波長為358nm，流速1mL/min，柱溫30℃。結果 不同產地5批桑葉原藥材、流浸膏和干膏各樣品之間的蘆丁含量具有明顯的差異，即便是同一產地不同批號的樣品蘆丁含量也存在很大的差別。其原藥材、流浸膏和干膏蘆丁含量的大小次序是一致的，廣西090901的含量最高分別是0.30%、0.124%和0.048%，湖北2最低分別是0.11%、0.095%和0.035%。浸出物的含量測定亦有差異，但均符合標準。水分測定幾乎無差異符合規(guī)定。結論 通過對桑葉藥材浸出物和指標成份的含量測定，可從定量的角度更好地對藥材質量進行控制。

桑葉；浸出物；高效液相色譜法；含量測定

桑葉為桑科植物桑Morusalba L的干燥葉。中國是桑樹的故鄉(xiāng)，其資源極為豐富，品種繁多，分布于中國大部分地區(qū)，以江蘇、浙江和四川等地產量較大［1］。桑葉性寒、味甘苦，具有疏散風熱，清肺潤燥、清肝明目、涼血止血之功效，是常用中藥之一。本草綱目記載，桑葉乃手足陽明之藥,汁煎代茗，能止消渴，名目長發(fā)?，F(xiàn)代藥理證明桑葉具有降血糖、降血壓及抗衰老、抗腫瘤、抗心腦血管疾病和抗菌與抗病毒等多種藥理作用。桑葉中含有黃酮及其苷、生物堿、多糖、揮發(fā)油、各種氨基酸、微量元素等多種成份[2]，黃酮類成份是其主要之一[3]。蘆丁是桑葉所含黃酮類成份主要一種。因產地、采集時間不同以及炮制方法等原因會導致其藥材質量有很大的差異。本實驗主要采用HPLC法通過對桑葉提取物、蘆丁含量測定和薄層色譜鑒別等分析研究藥材質量，為更好地開發(fā)利用桑葉資源并評價藥材內在質量提供依據(jù)。蘆丁的化學結構式如圖1。

1 儀器與材料

LC-10ATvp高效液相色譜儀（島津，日本），SPD-10Avp可見紫外檢測器，HH-6恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠），DL-360A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司），F(xiàn)A/JA系列電子天平（上海精天電子儀器有限公司），JY 20002電子天平，GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

桑葉批號分別為廣西090901、廣西090903、廣西091002，湖北2，山東等均為市售。對照品蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號0080-9705）；桑葉（中國藥品生物制品檢定所，批號121123-200904）。甲醇、乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司），醋酸（分析純，天津大茂化學試劑廠），蒸餾水(屈臣氏香港有限公司)。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品粉末2g，置圓底燒瓶中，加甲醇50mL，加熱回流3min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解即為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 取桑葉對照藥材2g，加甲醇同以上方法制成對照藥材溶液。

2.1.3 色譜鑒別 吸取上述兩種溶液各5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:2:1)的上層溶液為展開劑，置用展開劑預飽和10min的展開缸內，展開約至8cm，取出、晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視[4]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。色譜圖如圖2。

2.2 浸出物蘆丁含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品10.00mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為100.0mg/L的溶液，作為蘆丁對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定桑葉1g,置25mL容量瓶中，甲醇超聲提取30min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻即得。

圖1 蘆丁化學結構式。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-乙腈-醋酸-水（15:10:2.6:72.4）為流動相，檢測波長為358nm，流速1mL/min，進樣量10μL，柱溫30oC，理論塔板數(shù)按蘆丁計算應不低于3000。蘆丁與相鄰成份色譜峰的分離度應不小于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05。色譜圖如圖3。

2.2.4 線性關系考察 精密量取蘆丁對照品容液0.1、0.2、0.5、0.8、1.2mL分別置于10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成質量濃度為10.0、20.0、50.0、80.0、120.0mg/L的系列標準溶液，分別精密吸取上述溶液各10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)為縱坐標，溶液質量濃度(ρ/mg·L-1)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=1.828×107ρ-9.11×102(r=0.999 9)。結果表明蘆丁在質量濃度10.0、20.0、50.0、80.0、120.0mg/L內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL進樣，按“2.2.3”條色譜條件重復進樣6次，測量蘆丁峰面積，計算RSD=1.08%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 將供試溶液室溫放置，按“2.2.3”條色譜條件,分別在制備供試溶液后的0、1、2、4、6、8h進樣，測定峰面積RSD=1.46%，表明供試溶液在8h內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批的桑葉藥材樣品5份,每份約1g，按“2.2.2”條制成供試溶液，在“2.2.3”條色譜條件下測定。測定結果RSD為1.19%，含量測定方法重復性良好。

2.2.8 回收率試驗 取已知含量的桑葉(廣西產地，批號:090901)粉末供試品9份各2g精密稱定，分成3組，每組3份，分別精密加入質量濃度為100mg/L的蘆丁對照品溶液1.0、1.5、2.0mL,測定含量,計算平均回收率為98.9%,RSD為0.98%(見表1)。

2.2.9 供試品含量測定 分別取5批不同產地的桑葉藥材、桑葉流浸膏和干膏按照“2.2.2”條制成供試溶液，在“2.2.3”條色譜條件下測定，記錄色譜圖,按外標法計算樣品中蘆丁的含量(見表2)。

2.2.10 浸出物和水分的測定 分別按照醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定，用無水乙醇作溶劑，不得少于5.0%和按照水分測定法測定，不得多于15.0%[4](見表3)。

圖2 薄層色譜圖。

圖3 高效液相色譜圖。

表1 加樣回收率試驗結果（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 配制一定濃度的對照品溶液，以甲醇液為空白,用紫外-可見分光光度計掃描紫外圖譜，結果在358nm處有最大吸收，故確定檢測波長為358nm。

3.2 樣品提取條件的選擇 筆者比較了浸提法、回流法和超聲提取桑葉中蘆丁，但浸提法蘆丁峰分離不好，回流法工藝復雜，耗時較長，而超聲法簡便、快速、有效、靈敏，可作為供試品的提取方法。

表3 浸出物與水分測定結果

3.3 流動相的選擇 試驗考察了幾種流動相系統(tǒng)，結果表明用甲醇-乙腈-醋酸-水（15:10:2.6:72.4）流動相系統(tǒng)洗脫得到的桑葉色譜峰峰形好,柱效高,可達到理想的分離度。

3.4 薄層色譜供試品溶液所顯主斑點的顏色和位置與對照藥材溶液的斑點一致。故5種不同地區(qū)批號的供試品均含有桑葉原藥材的化學成份。

通過對不同產地5批桑葉原藥材、流浸膏和干膏的蘆丁含量測定，結果表明各樣品之間的蘆丁含量具有明顯的差異，即便是同一產地不同批號的樣品蘆丁含量也存在很大的差別。5批不同產地批號原藥材、流浸膏和干膏蘆丁含量的大小次序是一致的，廣西090901的含量最高分別是0.30%、0.124%和0.048%，湖北2最低分別是0.11%、0.095%和0.035%。浸出物的含量測定亦有差異，但均符合標準。水分測定幾乎無差異，符合規(guī)定。

[1] 江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(下冊)[M].上海：上海人民出版社，1997:323-325.

[2] 孫蓮,楊文菊,劉龍.桑葉揮發(fā)油氣相色譜-質譜指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志,2009,34(7)：879-883.

[3] 孫敏耀,唐文照,盧霞,等.分光光度法測定不同采收時間桑葉中總黃酮[J].中草藥,2004,35(10)：1190-1191.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業(yè)出版社,2005：31-56.

Objective To study the quality of medicinal herbs of Mulberry Leaf. The quality of medicinal herbs is studied quantitatively by determining the content of extracts and component indices of Mulberry Leaf medicinal herbs and TLC of the herbs. Methods The chromatographic separation was achieved on a Diamonsil ODS-C18 column with amobile phase of methanol-acetonitrile-aceticacid-water solution(15:10:2.6:72.4). The fl ow rate was 1.0 mL.min-1and the column temperature was 30℃. Results The differences can be seen obviously among 5 batches of sample of rutin content in origin mulberry leaf raw herbs, fl ow paste and dry extract from different places. Additionally, though the samples of rutin content of different batches from the same origin, there is also a big difference. The content of Guangxi 090901 maximum is 0.30%, 0.124% and 0.048%, and Hubei 2 lowest is 0.11%, 0.095% and 0.035%, respectively. Conclusion According to determination and analyses of the content of extracts and component indices of Mulberry Leaf medicinal herbs, the quality of medicinal herbs would be controlled better from a quantitative point of view.

Mulberry Leaf; Extract; HPLC; Content determination

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.25.098

300211 天津市河西區(qū)友誼醫(yī)院 （李克雄） 510006 廣東藥學院藥劑系（高崇凱）