青島市飼料獸藥檢測站 穆阿麗 李 彥 初曉娜 徐秀玲 李 輝 吳 燕

皮革水解蛋白因其成本廉價(jià)，被不法分子添加到乳及乳制品中用以提高蛋白質(zhì)含量，但是添加水解蛋白不僅會改變?nèi)榈目诟泻惋L(fēng)味，改變?nèi)榈娜芙舛?，降低乳中氨基酸的吸收利用率，而且“鞣革”下角廢料中含有的重金屬鉻，如果被人體吸收蓄積，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疏松、腫大、造成人體重金屬中毒（劉學(xué)琴等，2010）。2009年，衛(wèi)生部將皮革水解蛋白公布為《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單 （第二批）》。

羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白所特有的氨基酸，在正常膠原蛋白中含量約13.63%（李景紅等，2007），是衡量機(jī)體膠原含量的一個(gè)重要指標(biāo)，在彈性蛋白中含量極少，在其他蛋白質(zhì)中很少發(fā)現(xiàn)，因此由測定羥脯氨酸的質(zhì)量濃度再乘以相應(yīng)的系數(shù)可以得到膠原蛋白的含量（沈同和王鏡巖，1980）。目前羥脯氨酸的測定方法很多，主要有比色法、氨基酸自動分析儀測定法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等，本文就上述各種檢測方法作一闡述。

1 比色法

比色法又稱分光光度法，因其操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，是目前最為常用的一種方法。

比色法的原理是利用羥脯氨酸難揮發(fā)，在紫外區(qū)有微弱的吸收，沒有熒光基團(tuán)等性質(zhì)進(jìn)行檢測。膠原蛋白在濃酸的條件下，經(jīng)過高溫長時(shí)間水解，徹底變成游離的氨基酸。其中的羥脯氨酸首先用氯胺T氧化生成含吡咯環(huán)的物質(zhì)，然后用高氯酸溶液除去剩余的氯胺T，以對二甲基氨基苯甲醛溶液作為顯色劑，生成紅色化合物，用紫外可見分光光度計(jì)測定558 nm處的吸光值，從而得到羥脯氨酸的質(zhì)量濃度。

劉學(xué)琴等（2010）用比色法測定生鮮乳中皮革水解蛋白得出羥脯氨酸濃度在0～2.0 μg/mL呈良好的線性關(guān)系，R=0.9998，其平均回收率為100.2%。李景紅等（2007）用此法測得的回收率為94.38%～102.61%，重復(fù)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06，變異系數(shù)為1.74%。孔曉峰等（2011）采用此法測定結(jié)果表明，L-羥脯氨酸為0.00～1.11μg/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系（r=0.9990），在100～300 μg/mL時(shí)平均回收率為98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3%。王紅道等（2009）采用比色法測定乳制品中摻加動物膠原水解蛋白，回收率為96.7%～109.2%，平均回收率為100.4%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05，變異系數(shù)為1.56%。戴絢麗等（2009）研究得出該方法的線性范圍為0.002～3 μg/mL，回收率為90.6%～94.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<1.5%。張笑等 （2010）采用比色法測定得出的檢出限為2.1 μg/g，回收率為91.6% ～101.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.71%～2.45%。

通過對以上實(shí)驗(yàn)研究可以看出，采用比色法測定皮革水解蛋白其回收率均較高，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的一般需求。目前用該法水解樣品最少也需要 6 h（劉學(xué)琴等，2010）。 丁毅等（2011）研究了一種微波輔助水解比色法測定動物水解蛋白中羥脯氨酸的快速檢測方法，結(jié)果表明：通過微波輔助水解法對動物水解蛋白水解4～8 min與傳統(tǒng)加熱水解16 h所得的羥脯氨酸含量基本相同，采用吉大-小天鵝所研制的新型羥脯氨酸快速檢測儀及其配套試劑盒進(jìn)行測定，羥脯氨酸濃度范圍為0.10×10-3～2.50×10-3g/L時(shí)，其吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率90%～105%。采用該方法和儀器可以作為乳及乳制品中水解蛋白的快速篩選方法。

2 氨基酸自動分析儀測定法

氨基酸自動分析儀測定法的原理，是L-羥脯氨酸經(jīng)過陽離子交換柱的分離作用，能與其他氨基酸分離，再與茚三酮反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物，在波長440 nm檢出。

曾暖茜等（2008）用氨基酸自動分析儀測定乳制品中L-羥脯氨酸，當(dāng)L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為5～30 mg/L，L-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好，樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，加標(biāo)回收率為94.9%～105%。張秀堯等（2009）采用此法測定得出檢出限為0.3 mg/L，加標(biāo)回收率為96.8%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%～4.9%。

與比色法相比，氨基酸自動分析法避免了氨基酸衍生產(chǎn)物的多樣性和氨基酸衍生不徹底等問題，樣品處理簡便易操作，快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，但其費(fèi)用較高，普通實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)，而且存在需要較多緩沖液、反應(yīng)溫度高、反應(yīng)速度慢、用途單一等局限。

3 高效液相色譜法

采用高效液相法（HPLC）測定羥脯氨酸含量，常用的衍生法有柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生法有很多缺點(diǎn)，如色譜儀器較復(fù)雜，需要額外的泵和反應(yīng)器，而且由于衍生劑的影響對檢測設(shè)備要求很高，所以現(xiàn)在常使用柱前衍生法。柱前衍生是一種先將氨基酸轉(zhuǎn)化成衍生物，再進(jìn)行色譜分離的衍生方法。柱前衍生高效液相色譜法分析L-羥脯氨酸常用的柱前衍生試劑是鄰苯二甲醛 （Hutson 等，2003）、丹酰氯（Sormiachi等，1995）、氯甲酸芴甲酯、2，4-二硝基氟苯 （李景紅和孟祥晨，2008）。

李景紅和孟祥晨（2008）采用高效液相色譜測定牛乳中摻加膠原水解蛋白，以2，4-二硝基氟苯為衍生試劑。研究表明，羥脯氨酸質(zhì)量濃度為2～10 mg/L時(shí)，濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系，回收率為93.47%～101.20%，檢出限為2.5 mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%。金蘇英等（2009）采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定奶粉及其他乳制品中L-羥脯氨酸的含量。以6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯 （AQC試劑）衍生水解樣品中的L-羥脯氨酸。結(jié)果顯示，濃度為0～2.05 mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系（r=0.9991），加樣回收率為95.1% ～101%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%（n=7）。胡華等（2010）采用柱前衍生法分析醬油中羥脯氨酸含量。樣品經(jīng)乙醇提取，以2，4-二硝基氟苯為衍生試劑，L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度與其峰面積在10～320mg/L時(shí)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9992。回收率為97.19% ～110.18%，檢出限為2.5 mg/L。

上述研究表明,高效液相色譜法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的重現(xiàn)性，具有分析時(shí)間短，成本低，重現(xiàn)性好，適用樣品范圍廣等特點(diǎn)，可作為乳及其他乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測方法。但由于該方法要對樣品進(jìn)行衍生，反應(yīng)操作復(fù)雜，而且有些氨基酸衍生物不穩(wěn)定，衍生反應(yīng)的副產(chǎn)物和試劑本身會對測定產(chǎn)生干擾。趙燕燕等（2010）采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法 （HPLCELSD）測定奶制品中動物水解蛋白含量，該法不需對樣品進(jìn)行衍生，操作簡單，靈敏度高。結(jié)果表明，羥脯氨酸的線性范圍為10～1000 μg/mL，r=0.99993（n=5），最低檢出限為 5 μg/mL，平均回收率為99.83%，RSD為2.77%。

4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）是利用質(zhì)譜靈敏、專屬、能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的特點(diǎn)，將高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的一種方法。

王一紅等（2006）采用HPLC-MS法，用電噴霧ESI源，在正離子模式下建立了18種游離氨基酸的測定方法，通過選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）方式對18種氨基酸的母離子及子離子進(jìn)行監(jiān)測，并用三級四極質(zhì)譜測定。測得結(jié)果回收率為95%～104%，相關(guān)系數(shù)0.9931～0.9999，檢出限為0.5～8 mol/mL。

夏金根等（2008）建立了一種簡單、快速地測定膠原蛋白中羥脯氨酸的高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（HPLC-ESI/MS）方法。以茶氨酸為內(nèi)標(biāo)，利用質(zhì)譜定性定量測定羥脯氨酸。濃度為11.7～117 mg/L時(shí)，羥脯氨酸與內(nèi)標(biāo)物茶氨酸的峰面積比和羥脯氨酸的質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9993。含量測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.87%，回收率為97.85%～101.76%。

此方法分析時(shí)間短且無需衍生處理，抗干擾能力強(qiáng)，能準(zhǔn)確快速地測定膠原蛋白中羥脯氨酸的含量，但該方法因其實(shí)驗(yàn)設(shè)備、耗材貴，方法不完善等，目前尚未廣泛采用。

5 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳是一種可對多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析的重要液相分離技術(shù)，具有進(jìn)樣量少、絕對靈敏度高、分辨率高等特點(diǎn)。將毛細(xì)管電泳與光學(xué)檢測或電化學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合，可以對氨基酸進(jìn)行分離。

薛靜等（2005）研究表明，毛細(xì)管電泳-聯(lián)吡啶釕電致化學(xué)發(fā)光法，可以檢測人尿中脯氨酸和羥脯氨酸含量。而且該法還可排除其他多種氨基酸對羥脯氨酸的干擾，并具有毛細(xì)管電泳分離羥脯氨酸的高效性和電致化學(xué)檢測的靈敏性。

鄒曉莉等（2006）采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法分離測肌腱中的L-羥脯氨酸。結(jié)果表明，在（0.5～8）×103μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.5 μg/L。相對遷移率和相對峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.0%和6.1%，加標(biāo)回收率為95%～110%。毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測可大大提高測定的靈敏度，已有諸多報(bào)道采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法測定氨基酸，并取得滿意的分析結(jié)果（Yong等，2001）。而將該法用于測定L-羥脯氨酸，國內(nèi)外僅有少量報(bào)道（Dugan 等，2000）。

6 小結(jié)

羥脯氨酸是膠原蛋白中所特有的氨基酸，以羥脯氨酸為特征性指標(biāo)是檢測乳及乳制品中皮革水解蛋白的常用方法。目前檢測乳及乳制品中皮革水解蛋白的方法都需要進(jìn)行水解或衍生，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的需要，因此一種能夠簡便、快速、準(zhǔn)確測定羥脯氨酸的方法或儀器，是我們今后研究的主要方向。

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