李文君 侯玉澤 胡驍飛 王 坤 裴亞峰 張改平 鄧瑞廣

(河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽471003)

1959年，Yalow等［1］將放射性同位素示蹤與免疫反應相結合建立了放射免疫測定法，實現了痕量分析化學方面的重大突破，從而開創(chuàng)了標記免疫分析這一嶄新領域。此后，一系列標記免疫分析方法紛紛涌現并不斷發(fā)展，如酶聯免疫吸附法、熒光免疫測定法、免疫層析測定法、免疫傳感器測定法等等。免疫分析已經發(fā)展成為一門跨學科新型分析技術。隨著人們對免疫學理論認識的深入，各種免疫分析檢測技術也不斷地被完善。目前，免疫分析檢測技術正朝著定量、多組份分析;高靈敏度、高特異性、方便快捷、經濟適用的方向發(fā)展。量子點標記免疫技術由于具有上述特征，而受到廣泛關注。

1 量子點

1.1 量子點的特性 量子點主要是由主族元素Ⅱ～Ⅵ，Ⅲ～Ⅴ如CdSe、CdTe、InP組成的納米顆粒，粒徑一般介于1～100 nm之間。由于電子和空穴被量子限域，連續(xù)的能帶結構變成具有分子特性的分立能級結構，受激后可以發(fā)射熒光。量子點由于存在顯著的量子尺寸效應和表面效應，從而使它具有常規(guī)材料所不具備的光吸收特性，使其應用領域越來越廣，特別是其在臨床檢驗學和免疫學檢測研究中的應用價值，引起了科學工作者的極大關注，發(fā)光量子點作為熒光探針標記生物大分子，是近年來納米材料在生物分析領域的重要應用之一［2-4］。作為一種新型的熒光探針，與傳統(tǒng)的試劑相比具有以下特性:量子點的熒光強度強，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強。Chan等［2］通過實驗證明ZnS包覆的CdSe比羅丹明6G分子要亮20倍和穩(wěn)定100～200倍，可以受多次激發(fā)，并且標記后對生物大分子的生理活性影響很小，因此為研究生物大分子之間的長期作用提供了可能。量子點的特殊結構導致了它具有表面效應、量子尺寸效應、介電限域效應和宏觀量子隧道效應［5］。

量子點具有“調色”功能，不同粒徑的量子點具有不同的顏色，激發(fā)量子點的激發(fā)波長范圍很寬，且連續(xù)分布，所以可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點而獲得多種顏色標記，是一類理想的熒光探針［3，6］。

激發(fā)波長比較寬，而發(fā)射波長比較窄。量子點的激發(fā)光波長范圍很寬，只要能量大于其最小激發(fā)波長的光都可以對其進行激發(fā)［7］。同時量子點還具有較大的斯托克位移和狹窄對稱的熒光譜峰，其半高峰寬常常只有40 nm或更小，這樣就允許同時使用不同光譜特征的量子點，發(fā)射光譜不出現交疊，或只有很少交疊，使標記生物分子熒光譜的區(qū)分、識別變得很容易。

良好的生物兼容性。用量子點做標記物對生物大分子標本的活性無傷害，而且量子點與生物大分子的偶聯方法和方式相對比較單一，不像傳統(tǒng)的標記試劑，每種試劑都需要特定的偶聯方法。

量子點熒光壽命長。典型的有機熒光染料的熒光壽命僅為幾納秒(ns)，這與很多樣本的自發(fā)熒光衰減的時間相當。而量子點的熒光壽命可持續(xù)長達數十納秒(20 ns～50 ns)，這使得當光激發(fā)數納秒以后，大多數的自發(fā)熒光背景已經衰減，而量子點熒光仍然存在，此時即可獲得無背景干擾的熒光信號［2，8］。

2 量子點與靶標分子偶聯

2.1 量子點與生物大分子偶聯 近四十年來，量子點的制備從有機相到水相，從低熒光量子產率到高熒光量子產率，從短熒光壽命到長熒光壽命，量子點的制備技術在不斷發(fā)展。目前，量子點的制備主要有兩種途徑，即有機相制備和水相制備。有機相中制備的量子點具有較高的熒光量子產率、較窄的熒光半峰寬、較好的單分散性和穩(wěn)定性，但存在試劑毒性強、實驗成本高、操作安全性低等諸多缺點。水相制備量子點具有試劑無毒、廉價、操作簡單、環(huán)境友好及高度的重現性［9，10］。同時，水相合成的量子點由于本身帶有-COOH，不必經過繁瑣的轉相程序就可以直接溶于水溶液中，與生物分子進行連接［11］。目前已報道的連接方法都是基于下列原理:雙功能連接試劑法、靜電吸引法和生物素-親和素法。

2.1.1 雙功能連接試劑法 交聯劑是一類小分子化合物，分子量一般在200～600之間，具有2個或者更多的針對特殊基團(氨基、巰基等)的反應性末端，可以和2個或者更多的分子分別偶聯從而使這些分子結合在一起［12］。

2.1.2 靜電吸引法 正電荷氫核遇到另一個電負性強的原子時，就產生靜電吸引。表面帶負電的量子點與帶正電的雙功能重組蛋白區(qū)域可通過靜電吸引連接起來，而不需要其他試劑，且已成功的用于細胞成像［13］。Wu 等［14］利用直徑在 7.4 ～ 10 nm 的CdSe-ZnS量子點標記了細胞，同時識別細胞表面的Her2及胞漿微管蛋白，用來檢測核抗原。

2.1.3 生物素-親和素法 生物素-親和素系統(tǒng)(Biotin-avidin system，BAS)是70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應放大系統(tǒng)，在生命科學研究中有著廣泛的應用。由于它具有生物素與親和素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高［15］。

2.2 量子點標記蛋白質 量子點最初用于生物領域是應用于簡單的生物大分子，鏈接方法是將量子點用帶有氨基或羧基的試劑修飾，改變溶液環(huán)境，通過共價偶聯或靜電作用等完成量子點與生物大分子(蛋白質、核酸和生物酶等)的鏈接。

曾慶輝等［16］應用連續(xù)離子層吸附反應(SILAR)技術，在水溶液中合成了高效穩(wěn)定的CdTe/CdS核殼量子點，通過靜電吸附與共價連接兩種方式對人免疫球蛋白IgG進行標記。電泳技術已證明，應用這種量子點成功地實現了對蛋白質分子的生物標記。

Hua等［17］通過巰基乙酸對有機溶劑里的量子點進行改性，然后用EDC和NHS使量子點與羊抗人抗體偶聯。柱子純化以后進行表征分析發(fā)現，羊抗人抗體的圓二色性光譜圖和量子點標記抗體以后的色譜圖相近，表明了抗體在與量子點偶聯以后的二級結構仍然很完整。最后又進行了抗原抗體的識別反應，印證了耦合物保留了抗體的活性。這個實驗證明了用量子點標記生物蛋白是可行的，同時也為量子點在生命科學的應用奠定了理論基礎。

3 量子點標記技術在熒光免疫學檢測中的應用

3.1 量子點標記抗原抗體的熒光免疫分析 目前量子點標記最為活躍的領域是在熒光免疫方面。借助于抗原-抗體之間的特異性識別作用完成各種研究。1998年，Chan等［2］發(fā)現在牛血清蛋白(BSA)中，多克隆抗體能識別量子點標記的免疫球蛋白(IgG)，使量子點聚集在一起;而沒有這種抗體，QDIgG結合體均勻地分散于BSA中，證明用量子點標記的免疫球蛋白分子(IgG)能識別專一的抗原和抗體。這一研究為以后的量子點在熒光免疫分析中的研究奠定了基礎。

2002年，Goldman等［18］將量子點與抗體結合用于熒光免疫分析。他們利用工程重組蛋白通過靜電作用結合到量子點上，然后再與抗體結合，通過親和色譜將結合與來結合的分子分離，再將與抗體連接的量子點應用直接與間接ELISA的方法成功的對葡萄球菌腸毒素和2，4，6-三硝基甲苯進行了熒光免疫分析。后來，Goldman等［19］又將抗生物素蛋白作為一種受體蛋白與量子點連接，從而使量子點可以與生物素化的蛋白偶聯。這種受體蛋白為將抗體連接到量子點上提供了一種分子連接的橋梁。也使抗體與量子點的偶聯物能應用于熒光免疫分析。應用這種方法去檢測毒素，如SEB、choleratoxin等，可以達到用有機染料進行標記的同等的檢測限。Lingerfelt等［20］也用交聯生物素的量子點對葡萄球菌腸毒素B進行了免疫色譜檢測，這種方法的檢測限最低可達10 ng/ml。

2011年，楊淑平等［21］分別采用巰基乙酸和谷胱甘肽作穩(wěn)定劑，水相合成CdTe量子點，再包覆CdS制備核殼型CdTe/CdS量子點。以EDC和NHS作交聯劑將CdTe/CdS量子點標記到嘔吐毒素抗體上，然后用牛血清蛋白封閉抗體。研究發(fā)現，谷胱甘肽穩(wěn)定劑優(yōu)于巰基乙酸。與CdTe量子點相比，谷胱甘肽修飾的CdTe/CdS量子點其熒光的強度和穩(wěn)定性分別提高6倍和2倍以上。監(jiān)測不同儲藏時間的CdTe/CdS量子點-抗體復合物與嘔吐毒素免疫反應前后熒光強度變化值，結果顯示抗體至少可以穩(wěn)定7天。由此建立了一種新的嘔吐毒素熒光免疫監(jiān)測方法。

3.2 量子點標記生物素親和素的熒光免疫分析2009年，錢建瑞等［22］利用量子點標記的鏈霉親和素為標記試劑，將生物素-親和素系統(tǒng)應用于熒光免疫分析中，建立了一種測定雌三醇含量的分析方法。在選定的實驗條件下，雌三醇濃度在0.01～1000 ng/ml濃度范圍內與相對熒光強度有良好的線性關系，方法的檢出限為 0.0029 ng/ml。對 0.1 ng/ml和100 ng/ml的雌三醇標準溶液進行十次平行測定，求得其相對標準偏差均小于10%。

2011年，劉曉紅等［23］建立了熒光量子點標記-免疫分析技術聯用檢測炭疽芽孢桿菌的方法。通過抗原抗體反應，結合生物素與親和素間的特異性相互作用，將QDs特異性標記在炭疽芽孢桿菌上，并利用熒光顯微鏡和熒光分光光度計進行了驗證。采用實驗室自制的便攜式熒光檢測系統(tǒng)對標記QDs的炭疽芽孢桿菌樣品進行定量檢測。表明炭疽芽孢桿菌濃度與相對熒光強度呈良好的線性關系，相關系數R為0.9554，檢測相對標準偏差為2.2%。

3.3 量子點標記與免疫層析快速檢測技術 將熒光分析與免疫層析結合起來，量子點在萊克多巴胺及鹽酸克倫特羅的快速檢測中相較于膠體金靈敏度有了較大的提高。

2009年，張國華等［24］通過萊克多巴胺抗原抗體的制備、量子點的制備、試紙條的組裝和測試等步驟研究一種將量子點應用于萊克多巴胺免疫層析試紙條的新方法。結果表明，萊克多巴胺快速檢測試紙條的檢測限為3 ng/ml，檢測時間為10分鐘。以量子點為標記物通過免疫層析的方法檢測RAC，是對以往膠體金層析技術的一種突破，實驗證明利用量子點優(yōu)越的熒光特性將量子點作為標記物取代膠體金可以提高RAC試紙條的檢測限，同時能夠很好的保證以往RAC膠體金試紙條的檢測范圍和檢測的特異性。

2010年，胡華軍等［25］采用巰基丁二酸作為表面修飾劑，水相法合成水溶性的CdTe/ZnSe核殼量子點，然后在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的作用下，將CdTe/ZnSe核殼量子點與抗克倫特羅多克隆抗體(Anti-CLE pAb)連接。通過凝膠電泳和斑點雜交實驗，驗證CdTe/ZnSe核殼量子點與Anti-CLE pAb連接成功，并且CdTe/ZnSe-Anti-CLEpAb偶聯物能識別克倫特羅-BSA抗原(CLE-BSA)。將合成的CdTe/ZnSe-Anti-CLE pAb偶聯物作為指示克倫特羅(CLE)分子的熒光標記物，制備出一種用于檢測CLE的免疫層析試紙條，其最低檢測量可達1μg/L。此結果表明量子點能用作熒光標記物制備快速檢測免疫層析試紙條，能滿足國家對食品安全檢測快速、靈敏的要求。

4 展望

綜合現在的免疫學檢測方法，量子點在標記免疫分析方面展現了誘人的前景。相較于以往的有機熒光染料，其具有熒光強度強、穩(wěn)定性好、熒光壽命長的特點。因此可以完全取代過去的有機染料進行熒光分析。另外將熒光分析與免疫層析相結合應用于現在的免疫層析快速檢測，其靈敏性相較于膠體金有較大的提高。相信，隨著量子點制備及標記技術的成熟，其將在生物醫(yī)學及免疫學檢測中發(fā)揮重要的作用。另外利用不同粒徑量子點具有不同顏色的特點將不同的量子點標記不同的抗體，并且制備成免疫層析試紙條，將有望實現利用一條試紙條同時檢測不同的物質，極大的提高了食品安全檢測的效率。但是，量子點在制備過程中的穩(wěn)定性及量子產率還仍然存在問題，仍是我們在研究量子點標記技術及應用于免疫學檢測中不可忽視的難題。

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