劉吉成，周嵩煜

(1.廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西玉林537000;2.廣西南寧食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧530001)

正骨水由九龍川、木香、海風(fēng)藤、草烏等二十六味中藥提取而成，具有活血祛瘀，舒筋活絡(luò)，消腫止痛之功效，用于跌打扭傷，骨折脫位以及體育運(yùn)動前后消除疲勞等［1］;因其中草烏藥材含有烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等酯型生物堿成分，這些生物堿既是有效成分又是毒性成分，藥材的炮制方法和產(chǎn)地及采收時間不同，其毒性成分量差異較大［2-3］，使用中若有不慎即可引起中毒，甚至死亡［4］。目前對含有烏頭類藥材的中成藥研究中，多數(shù)僅控制了烏頭堿的限度［5］，但該類藥物中還含有次烏頭堿和新烏頭堿也屬于雙酯型生物堿，應(yīng)與烏頭堿一起加以控制。由于正骨水遠(yuǎn)銷新加坡、馬來西亞等東盟各國，在一些國家進(jìn)出口過程中要求提供烏頭類生物堿的檢測方法和限度標(biāo)準(zhǔn)，由于《中國藥典》2010年版一部中沒有這方面的規(guī)定，本試驗(yàn)采用LC-MS/MS測定正骨水中的烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿，方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠?qū)φ撬峁┯行У馁|(zhì)量評價和質(zhì)量控制。

1 儀器和試劑

1.1 儀器Waters2695高效液相-Quattro MicroTMAPI質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司);LC/MS20-1氮?dú)獍l(fā)生器(英國Domnick hunter公司);K280R高速冷凍離心機(jī)(英國森特恩);Hei-VAPA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Heidolph公司);XS-205DU電子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑乙腈、正己烷、甲酸為色譜純，水為超純水，乙醚，氨水等均為分析純。烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為:110720-200410，110798-200404，0799-9403;正骨水由廣西玉林制藥有限公司提供，批號為:20110117、211174、211175、211233。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［3，6］XTerraMS?C18色譜柱，5 μm，2.1 mm×150 mm，柱溫35℃，體積流量0.25 mL/min，流動相為乙腈-10 mmol/L醋酸胺(含0.1%甲酸)(35∶65)，進(jìn)樣量20 μL。在上述條件下對照品3種成分各定量離子的色譜圖見圖1。

圖1 3種烏頭類生物堿對照品溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in standard solution

2.2 質(zhì)譜條件［6-8］電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓1.8 kV;離子源溫度120℃;脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣氮?dú)怏w積流量為850 L/h;錐孔氮?dú)怏w積流量為100 L/h;碰撞氣為氬氣，質(zhì)量分析器為四級桿;定性離子對，定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量見表1。

2.3 供試品溶液的制備［9-12］精密量取本品50 mL，置100 mL平底燒瓶中，在40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，剩余液體約10 mL轉(zhuǎn)移到50 mL具塞離心管中，用氨水5 mL洗滌平底燒瓶，洗滌液體一并轉(zhuǎn)入50 mL具塞離心管中，加15 mL乙醚洗滌平底燒瓶，一并轉(zhuǎn)入50 mL具塞離心管中，渦旋振搖提取1 min，6 000r/min離心10min，把乙醚層轉(zhuǎn)移到100 mL平底燒瓶中，反復(fù)用乙醚提取3次，每次15 mL，合并乙醚液至100 mL平底燒瓶中，于35℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸干乙醚，殘?jiān)芗尤? mL1%甲酸，2 mL正己烷，超聲2 min，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，渦旋振搖，離心，取下層水相過濾即得，供試品圖譜見圖2。

表1 3種烏頭類生物堿質(zhì)譜條件參數(shù)Tab.1 Mass spectreometry parametres of the three kinds of aconitine alkaloids

圖2 供試品溶液中3種烏頭類生物堿MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in sample solution

2.4 對照品溶液的制備取烏頭堿對照品11.40 mg、次烏頭堿13.28 mg、新烏頭堿9.95 mg各置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再分別精密量取1 mL，置同一100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度作為混合對照品貯備液。

2.5 線性關(guān)系考察精密量取混合對照品貯備液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:烏頭堿:Y=47.374 2X－0.136 0(r=0.999 97);次烏頭堿:Y=78.384 6X－23.14(r=0.999 93);新烏頭堿:Y=66.887 4X－16.69(r=0.999 70)。結(jié)果表明烏頭堿在1.14～57.0 ng/mL、次烏頭堿在1.328～66.40 ng/mL，新烏頭堿在0.995～49.75 ng/mL范圍線性關(guān)系良好。

2.6 專屬性試驗(yàn)取不加草烏制備的供試品溶液，按照上述2.3項(xiàng)下供試品處理過程處理，制備空白供試品溶液，結(jié)果空白樣品中沒有檢測到烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿，圖譜見圖3。

圖3 陰性供試品MRM色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of negative samples

2.7 精密度試驗(yàn)取含烏頭堿質(zhì)量濃度為22.80 ng/mL，次烏頭堿質(zhì)量濃度為26.56 ng/mL和新烏頭堿質(zhì)量濃度為19.90 ng/mL的混合對照品溶液，進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄定量離子的峰面積，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的RSD分別為1.8%、2.3%和2.2%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)取本品(批號:211233)共6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算質(zhì)量濃度和RSD值，烏頭堿的質(zhì)量濃度為0.095 ng/mL，RSD為3.6%;次烏頭堿的質(zhì)量濃度為1.064 ng/mL，RSD為2.1%和新烏頭堿的質(zhì)量濃度為0.090 ng/mL，RSD為3.0%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下樣品，分別于0、3、6、10、15、24 h進(jìn)樣分析，記錄定量離子峰面積，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的RSD分別為2.3%、1.3%和1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收試驗(yàn)分別精密量取含烏頭堿對照品質(zhì)量濃度為114 ng/mL溶液0.05 mL，含次烏頭堿132.8 ng/mL溶液0.5 mL，含新烏頭堿99.5 ng/mL溶液0.05 mL，置100 mL平底燒瓶，用氮?dú)獯抵两?，再精密量取供試品溶?0 mL(批號:211233)，按照2.3項(xiàng)下制備成供試品溶液，進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果表明方法回收率好，準(zhǔn)確度高，結(jié)果見表2。

表2 3種烏頭類生物堿加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for the three kinds of aconitine alkaloids

2.11 樣品測定精密量取本品50 mL，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)下的色譜條件和質(zhì)譜條件測定供試品溶液，以外標(biāo)法定量，結(jié)果見表3。

表3 樣品的測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of the three kinds of aconitine alkaloids in the samples(n=3)

3 討論

3.1 測定方法的選擇曾經(jīng)摸索用普通的液相色譜來測定，由于正骨水是經(jīng)過蒸餾提取而制成的，并且不同產(chǎn)地和炮制方法的草烏藥材，其生物堿的含有量不一樣，在廠家提供的樣品中含3種烏頭堿的含有量都比較低，達(dá)不到液相的檢出濃度，由于LC-MS/MS具有靈敏度高，選擇性好，能夠很好的測定正骨水中的3種烏頭堿的含有量。

3.2 樣品的提取方法的選擇由于正骨水是由26味藥材提取而得，成分非常多，而且基質(zhì)復(fù)雜，也曾經(jīng)嘗試用直接進(jìn)樣來測定烏頭類生物堿，結(jié)果基質(zhì)效應(yīng)太嚴(yán)重，無法測定;并且正骨水中含有水，用普通的水浴很難蒸干，改用水浴減壓蒸干，最后也還有大概15 mL黏稠的液體，用氨水使成堿性環(huán)境，使成單體成分存在，再用乙醚提取，在提取過程中很容易乳化，改用離心能夠達(dá)到很好的分層。

3.3 檢出限的測定由于用LC-MS/MS測定，儀器靈敏度都非常高，最后測定出3種烏頭堿的檢出限均為0.01 ng/mL。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:621.

［2］張根衍，潘桂湘.液質(zhì)連用技術(shù)在烏頭類生物堿定性定量研究中的應(yīng)用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，12(6):26-29.

［3］李錚，張小茜，趙惠萍，等.液質(zhì)聯(lián)用測定烏頭飲片中生物堿的含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，5(16)增刊:27-28.

［4］遲曉娟，朱志杰，劉長華.高效液相色譜法測定骨刺消痛膠囊中烏頭堿的含量［J］.中國藥師，2008，11(10):1215-1216.

［5］李麗敏，王欣美，王柯，等.RP-HPLC測定鎮(zhèn)痛活絡(luò)酊中3種烏頭類生物堿含量［J］.中成藥，2008，30(12):1785-1789.

［6］熊小婷，吳惠勤，黃曉蘭.液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測血液中8種有毒生物堿［J］.分析化學(xué)，2009，37(10):1433-1438.

［7］夏燁，楊春華，劉靜涵，等.烏頭屬藥材特征成份二萜生物堿的電噴霧質(zhì)譜研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2009，21(3):1-5.

［8］邱俏檬，劉剛，梁歡，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法同時檢測兔血漿中3種草烏成分［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2009，16(2):106-108.

［9］朱俊訪，李卓亞，沈志濱，等.HPLC法測定不同地區(qū)制川烏中新烏頭堿、次烏頭堿及烏頭堿的含量［J］.食品與藥品，2008，10(9):44-46.

［10］丘振文，羅丹冬，王沛堅(jiān).HPLC法測定舒痹寧顆粒中次烏頭堿、新烏頭堿的含量［J］.中國新藥與臨床藥理，2008，19(4):304-306.

［11］辛楊，王淑敏，劉志強(qiáng).高效液相色譜法測定蒙藥那如3味丸中新烏頭堿的含量［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，24(1):28-29.

［12］王勇，鄧曉春，夏博.三種中成藥中烏頭生物堿飛行時間質(zhì)譜分析［J］.深圳大學(xué)學(xué)報:理工版，2009，26(3):257-261.