洪 亮 陳其御 王 萍 沈 強(qiáng) (皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室，安徽 蕪湖 24002)

1995年德國科學(xué)家Graham Pawelec小組研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞表面與老化關(guān)系最密切的抗原分子是CD28分子。到目前為止，人們已經(jīng)基本公認(rèn)CD28分子成為免疫老化的重要標(biāo)志之一，其在人類CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表面隨增齡而表達(dá)降低的證據(jù)可見于最近的一些報(bào)道中。CD28分子是表達(dá)在人類95%CD4+T細(xì)胞表面和50%CD8+T細(xì)胞表面的重要信號分子，主要參與T細(xì)胞的活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。其中外周血T細(xì)胞膜型CD28(mCD28)和血清中可溶性CD28(sCD28)的表達(dá)隨年齡的改變而不同。那么，益生菌是否通過改變CD28分子的數(shù)量和質(zhì)量來達(dá)到抗衰老的目的呢?本文就乳酸桿菌對老齡小鼠T細(xì)胞mCD28的表達(dá)水平和血清中sCD28的含量進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步在分子水平探討乳酸桿菌在抗衰老中的意義和作用，為免疫衰老機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)菌株 分別取凍干保存的Ⅱ型嗜酸乳酸桿菌株在MRS肉湯中復(fù)蘇增菌，并在固體培養(yǎng)基中接種生長，實(shí)驗(yàn)時(shí)將培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中的菌苔用PBS洗滌三次，并用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)各乳酸桿菌濃度至1×1010cfu/ml濃度懸液備用。

1.2 選擇試驗(yàn)動物 選取老齡KM小鼠(13～15月齡)80只，雌雄各半，飼養(yǎng)于普通環(huán)境中。其中每組再各隨機(jī)分為兩組，一組為試驗(yàn)組，另一組為對照組，每組20只。試驗(yàn)組每天每只老鼠腹腔注射乳酸桿菌0.2 ml/只，對照組每天每只老鼠腹腔注射生理鹽水0.2 ml/只，連續(xù)10 d。

1.3 標(biāo)本采集 第11天處死小鼠，每只分別收集肝素抗凝及不抗凝的老齡小鼠外周血2 ml，抗凝血經(jīng)分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，間接免疫熒光及流式細(xì)胞儀分析老齡小鼠T細(xì)胞mCD28的表達(dá)水平，ELISA檢測血清中sCD28的含量。

1.4 T細(xì)胞mCD28表達(dá)水平分析 常規(guī)淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，取一定量的細(xì)胞懸液(約1×106細(xì)胞/ml)，先加入CD28單抗溫育，待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，用FCM檢測其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。

1.5 血清中sCD28含量測定 選用自制CD28單抗8G8包被酶標(biāo)檢測板，用3%BSA封閉。分別加入不同濃度的rhCD28/Fc融合蛋白(0～64 ng/ml)和待測血清，37℃反應(yīng)2 h。充分洗滌后，再加入生物素標(biāo)記的識別另一抗原表位的CD28單抗2D5和HRP標(biāo)記的鏈霉親和素。洗滌后，加入TMB底物室溫反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)，置酶標(biāo)儀上測定OD。每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。以標(biāo)準(zhǔn)品rhCD28/Fc融合蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。根據(jù)待測樣本的OD值換算出相應(yīng)的sCD28的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 老齡鼠外周血T細(xì)胞mCD28的表達(dá) 經(jīng)間接免疫熒光及流式細(xì)胞儀分析，老齡鼠試驗(yàn)組外周血T細(xì)胞mCD28的陽性表達(dá)率為:雄性(51.64±7.86)、雌性(53.00±5.40);老齡鼠對照組外周血T細(xì)胞mCD28的陽性表達(dá)率為:雄性(45.56±3.62)、雌性(47.48±2.59)。其中，同一組內(nèi)雄性和雌性間比較均無顯著差異(P＞0.05);雄性試驗(yàn)組和雄性對照組之間比較有差異(P＜0.05);雌性試驗(yàn)組和雌性對照組之間比較有顯著差異(P＜0.01)。

2.2 老齡鼠血清中T細(xì)胞sCD28的表達(dá) 雄性(0.68±0.20)、雌性(0.73±0.22);老齡鼠對照組血清中T細(xì)胞sCD28的含量為:雄性(1.36±0.29)、雌性(1.45±0.27)。其中，同一組內(nèi)雄性和雌性間比較均無顯著差異(P＞0.05);同一性別內(nèi)試驗(yàn)組和對照組之間比較有顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

CD28分子最早是在PMA刺激活化的T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的，人與小鼠CD28分子的同源性為68%，CD28分子是一種相對分子量為44 kU的同源二聚體糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，可表達(dá)在95%CD4+T細(xì)胞表面和50%CD8+T細(xì)胞上〔1〕。CD28分子由胞外Ig的V樣區(qū)、穿膜功能區(qū)和胞漿功能區(qū)組成〔2〕，它即可以膜型形式表達(dá)在T細(xì)胞表面，也可以可溶形式存在于血液中，研究表明，mCD28在老年人T細(xì)胞上的表達(dá)呈增齡性減少〔3～5〕，而sCD28的含量在老齡人血清中較年輕人明顯升高〔6〕。有試驗(yàn)證實(shí):sCD28重組蛋白能抑制CD3單抗或絲裂原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化〔7〕，抑制細(xì)胞的增殖、分化及發(fā)揮免疫效應(yīng)，對T細(xì)胞的應(yīng)答產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用〔6〕。

乳酸桿菌作為一種益生菌，在生物拮抗、抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等方面都有一定的作用。本研究中老齡鼠外周血T細(xì)胞mCD28的陽性表達(dá)率試驗(yàn)組高于對照組，并且老齡鼠血清中T細(xì)胞sCD28的含量試驗(yàn)組低于對照組，但同一組內(nèi)，雄性與雌性小鼠的外周血T細(xì)胞mCD28和血清中T細(xì)胞sCD28的含量均沒有差異。研究表明:乳酸桿菌可影響T細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生細(xì)胞因子的功能，乳酸桿菌還可提高T細(xì)胞針對有絲分裂原的增殖能力，使T細(xì)胞數(shù)量增多〔8〕。CD28/CTLA4-B7作為T細(xì)胞活化的第二信號在T細(xì)胞的免疫應(yīng)答過程中起到關(guān)鍵的作用。在小鼠模型中，TCR信號與CD28/CTLA4-B7共刺激信號協(xié)同能引起多種細(xì)胞銀子轉(zhuǎn)錄和翻譯的上調(diào)、T細(xì)胞增殖等效應(yīng)，同時(shí)證實(shí)CD28/CTLA4-B7在自身免疫、腫瘤免疫和移植排斥反應(yīng)及老化均起重要作用〔1〕。因此，我們有理由推斷:乳酸桿菌的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用與CD28分子水平密切相關(guān)，相信在不久的將來乳酸桿菌的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制將會得到進(jìn)一步的闡述，其作為一種免疫調(diào)節(jié)劑具有良好的應(yīng)用前景。

1 郝秀麗，張逢春.CD28分子的研究進(jìn)展〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004;5(2):133-4.

2 錢 峰，吳俊英，李柏青.CD28協(xié)調(diào)刺激信號傳導(dǎo)的研究進(jìn)展〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·分子生物學(xué)分冊，2002;24(5):273.

3 Kozono Y，Abe R，Kozono H，et al.Cross-linking CD21/CD35 or CD19 increases both B7-1 and B7-2 expression on murine splenic B cells〔J〕.J Immunol，1998;160(5):1565-77.

4 Merino J，Martinez MA，Rubio M，et al.Progressive decrease of CD8 high+CD28+CD57-cells with aging〔J〕.Clin Exp Immunol，1998;112(1):48-60.

5 Boucher N，Dufreu-Duchesne T，Vicaut E，et al.CD28 expression in T cells aging and human longevity〔J〕.Exp Gerontol，1998;33(2):267-78.

6 石云杰，顧國潔，史進(jìn)方.老年人T細(xì)胞膜型CD28及血清中可溶性CD28的表達(dá)及其意義〔J〕.現(xiàn)代免疫學(xué)，2007;27(1):38-40.

7 Maria ST，Thomas LL，F(xiàn)lorentine M，et al.Lake of antibody practioner following immunization in old age:association with CD8+CD28－T cell clonal expansions and an imbalance in the prauction of Thl and Th2〔J〕.J Immunol，2002;169(6):5893-901.

8 Lim BK，Mahendran R，Lee YK，et al.Chemopreventive effect of Lactobacillus rhamnosus on growth of a subcutaneously implanted bladder cancer cell line in the mouse〔J〕.Jpn J Cancer Res，2002;93(1):36-41.