楊靖亞 陸曉帆 張 建 孫曉紅 晁若瑜 錢媛華 (上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，其廣泛分布于全世界的沿海岸及海水中，主要來源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品中［1］。近年來副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模以及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已成為世界各地由于食用了生的或未加工成熟的海產(chǎn)品而引起的食源性疾病的主要致病因素［2-7］，大多數(shù)現(xiàn)腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐等反應(yīng)，少數(shù)表現(xiàn)出頭痛、頭暈、發(fā)燒等臨床癥狀［1］。目前研究顯示，副溶血弧菌的主要致病因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素和尿素酶，分別有不耐熱溶血毒素(Thermolabile hemolysin，TLH)、耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin，TDH)、直接溶血相關(guān)毒素(TDH-related hemolysin，TRH)，其中耐熱直接溶血毒素TDH是主要的致病因子［8］。在臨床分離菌株中大多表現(xiàn)為TDH+株，而TRH+株為10% ～15%，少數(shù)副溶血弧菌具有TDH和 TRH雙陽性，環(huán)境中分離菌株幾乎無TDH［9，10］。該菌的血清分型 O 抗原為13型，K 抗原為71型，其中已知與人胃腸炎有關(guān)的O與K的組合有 75 種［11］。

本文以實(shí)驗(yàn)室自己制備的高純度TDH毒素蛋白作為免疫原免疫小鼠，旨在篩選制得高效、特異性強(qiáng)的副溶血弧菌TDH的單克隆抗體，并對其進(jìn)行生物學(xué)特性分析鑒定，以期為建立針對TDH的免疫學(xué)檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 致病性副溶血弧菌ATCC33846(標(biāo)準(zhǔn)菌株)購于北京中原公司;沙門氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌F188(從南美白對蝦分離出，只含TLH不含TDH，通過生理生化試驗(yàn)和PCR分析，確定為非致病性副溶血弧菌)菌株均由上海海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);6至8周齡清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠購于上海西普爾-必凱動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;SP2/0細(xì)胞由上海海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標(biāo)記二抗、純品小鼠 IgG、OPD 底物、PEG1500、HAT、HT 選擇培養(yǎng)基、抗體類型試劑盒、Mineral oil、HiTrap Protein G HP、PD-10 Desalting Columns均購于 Sigma公司;BSA(牛血清蛋白)購于上海正極生物有限公司;RPMI1640、胎牛血清均購于上海普飛生物有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫原的制備 37℃條件下對致病性副溶血弧菌ACTT33846進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)16小時(shí)，8 000 r/min離心取上清去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經(jīng)過DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖 G-75 層析純化 TDH［12］，冷凍干燥純化后的TDH，準(zhǔn)確稱量，溶解于少量pH7.4 0.01 mol/L的PBS中。

1.2.1.1TDH溶血活性及耐熱性測定 靜脈取新鮮兔血0.43 ml與20.0 ml的PBS(+)混合制作紅細(xì)胞懸液。在V形96孔板中預(yù)先每孔加入100 μl紅細(xì)胞懸液后分別再加入20 μl 2 mg/ml純TDH和20 μl 2 mg/ml經(jīng)過100℃水浴10分鐘熱處理的純TDH，之后將V形96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱在37℃條件下反應(yīng)24小時(shí)后，觀察結(jié)果。

1.2.1.2TDH變性溫度測定 利用差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimetry，DSC)來測量TDH的變性溫度。TDH檢測用量為4.500 0 mg，溫度設(shè)定范圍為25℃ ～125℃，時(shí)間為10分鐘［13］。

1.2.2免疫動(dòng)物 同時(shí)免疫4只8周齡雌性BALB/c小鼠，取純化后的TDH 10 μg與弗氏完全佐劑充分混合乳化后，通過腹腔注射進(jìn)行首次免疫，分別于3周后取5 μg TDH與弗氏不完全佐劑混合乳化進(jìn)行第2次和第3次免疫，每次間隔2周。在第3次免疫之后，對小鼠尾靜脈采血，利用間接ELISA法測其血清效價(jià)，選取最佳免疫小鼠，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1∶10 000以上即可最后的加強(qiáng)免疫，三天之后分離脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.3細(xì)胞融合 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶5的比例混合在一起，在50 ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液RPMI1640清洗并以1 000 r/min離心8分鐘;隨后棄去上清液，輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng);接著在37℃水浴作用下，加入1.0 ml PEG1500溶液;90秒后加入25 ml 37℃預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用;最后以1 000 r/min離心6分鐘，選用含15%胎牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸，以每孔100 μl加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合7～10天換用HT選擇培養(yǎng)液、20天后使用含15%胎牛血清的RPMI1640普通培養(yǎng)基。

1.2.3雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆 用抗原 1 μg TDH/孔包被96孔板，待測細(xì)胞上清液為一抗，采用間接ELISA檢測篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，選擇陽性孔并用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，當(dāng)克隆孔的陽性率為100%即可，最終挑選出穩(wěn)定分泌高特異性、高效價(jià)、高親和力抗體的雜交瘤細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)并保存于液氮中。

1.2.4腹水制備及純化 選擇8周齡的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml液體石蠟，7～10天后再次腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞于每個(gè)小鼠體內(nèi)，約5～7天便可收集腹水;采用飽和硫酸銨法和HiTrap Protain G親和層析柱純化抗體，最終PD-10 Desalting Columns去除小分子物質(zhì)，并運(yùn)用間接ELISA進(jìn)行效價(jià)測定和SDS-PAGE分析。

1.2.5單克隆抗體特異性鑒定 在37℃180 r/min恒定條件下，對沙門氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌和非致病性副溶血弧菌F188菌株進(jìn)行液體增菌搖床培養(yǎng)24小時(shí)后，對所有菌液進(jìn)行8 000 r/min離心10分鐘，并取各菌株對應(yīng)上清液100 μl包被酶標(biāo)板(每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔)，用PBS作空白對照，4℃孵育12小時(shí)。洗滌后，用封閉液封閉ELISA板(37℃ 120分鐘)。洗滌后，加入被檢測雜交瘤細(xì)胞上清液，0.1 ml/孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，0.1 ml/孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，加入底物(OPD)溶液，0.1 ml/孔，室溫避光顯色20分鐘。2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，測定各孔495 nm的OD值。以檢測孔與空白對照孔OD值的比值大于2.1(P/N≥2.1)為陽性結(jié)果。

因此，通過間接ELISA法檢測T9H4單克隆抗體與不同菌株培養(yǎng)離心后上清液中菌株分泌物的反應(yīng)，從而評(píng)價(jià)T9H4單克隆抗體的特異性。

1.2.6單克隆抗體免疫球蛋白亞類的鑒定 取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照 Sigma公司的鼠源單克隆抗體亞類鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7單克隆抗體親和力的測定 ELISA雙抗體夾心法確定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的濃度：取適宜濃度的純化兔抗鼠IgG抗體包被酶標(biāo)板，0.1 ml/孔，4℃過夜。洗滌后，用封閉液封閉ELISA板(37℃120分鐘)。加入被檢雜交瘤細(xì)胞上清液和系列稀釋的小鼠的IgG純品，0.1 ml/孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，加入適宜稀釋度的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，0.1 ml/孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，加入底物(OPD)溶液，0.1 ml/孔，室溫避光顯色20分鐘。2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，測定各孔495 nm的OD值。最后以小鼠IgG純品的不同濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的OD值，確定其中mAb的準(zhǔn)確濃度。

雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中mAb的親和常數(shù)測定(ELISA 間接法)：分別取 50、100、200 μg/ml三種倍比稀釋的TDH抗原包被酶標(biāo)板，0.1 ml/孔，4℃過夜。洗滌后，用封閉液封閉微板(37℃ 120分鐘)。洗滌后，加入系列稀釋的已知濃度的被檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，0.1 ml/孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，加入工作濃度的HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG抗體，0.1 ml/孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，加入底物(OPD)溶液，0.1 ml/孔，室溫避光顯色20分鐘。2 mol/L硫酸終止反應(yīng)后，測定各孔在495 nm的OD值。以被檢樣品不同濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出3條測定曲線，以各曲線上部趨于平坦的OD值為100%，查出其OD值為50%時(shí)點(diǎn)的mAb濃度。

按照下列公式計(jì)算親和常數(shù)K值：Ka=(n-1)/2(n［Ab’］t-［Ab］t)。其中 n=［Ag’］t/［Ag］t，［Ag’］t 和［Ag］t為不同包被抗原的濃度，［Ab’］t、［Ab］t是對應(yīng)不同包被抗原的濃度下，將抗體梯度稀釋得到最大吸光度一半處的抗體濃度(mol/L)［14，15］。

1.2.8雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性 將單抗細(xì)胞按照常規(guī)方法凍存與復(fù)蘇，穩(wěn)定傳代，取細(xì)胞上清間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)測定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用ANOVA分析方法對同組中不同數(shù)據(jù)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性評(píng)價(jià)(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。

2 結(jié)果

2.1TDH溶血活性鑒定 經(jīng)37℃ 24小時(shí)恒溫培養(yǎng)后，純化所得TDH對于兔子紅細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的溶血活性(圖1)，體現(xiàn)了該毒素的溶血和耐熱性特性，與已報(bào)道文獻(xiàn)［16］相符合。

2.2TDH變性溫度測定 DSC結(jié)果顯示整條曲線只有一個(gè)波峰，表明經(jīng)過三次層析后的TDH的純度較高，并且測得TDH的變性溫度為94.17℃(圖2)，體現(xiàn)了該毒素的耐熱穩(wěn)定特性。

2.3雜交瘤細(xì)胞株的建立 TDH分子量為46 kD，具有較強(qiáng)的免疫原性，經(jīng)過五次免疫，2號(hào)和3號(hào)小鼠都得到比較高的效價(jià)，其中2號(hào)和3號(hào)小鼠效價(jià)都達(dá)到1∶40 000以上，選擇其脾細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞融合。免疫接種小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和間接ELISA篩選，并通過3次亞克隆后得到1株能穩(wěn)定分泌抗TDH高特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為T9H4。

2.4單克隆抗體的效價(jià)測定 間接ELISA法分別測定了細(xì)胞上清液、腹水中和純化后的T9H4單克隆抗體效價(jià)(表1);經(jīng)連續(xù)傳代和-80℃凍存6個(gè)月后復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞仍能穩(wěn)定分泌抗體，間接ELISA檢測的細(xì)胞上清液效價(jià)和最初沒有差別，表明雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定地分泌抗TDH單克隆抗體。

圖1 溶血活性及耐熱性的測定Fig.1 Determination of hemolytic activity and thermostability

圖2 TDH的DSC曲線Fig.2 Curve of TDH with Differential Scanning Calorimetry

2.5單克隆抗體輕鏈、重鏈分子量 T9H4單克隆抗體經(jīng)飽和硫酸銨、HiTrap Protain G親和層析柱純化后SDS-PAGE電泳條帶較純化前腹水電泳條帶明顯減少，純化效果良好。同時(shí)SDS-PAGE電泳(圖3)顯示兩條單一目的條帶，即分別為T9H4單克隆抗體的重鏈50 kD和輕鏈23 kD，可知T9H4單克隆抗體分子質(zhì)量約為146 kD。

2.6單克隆抗體特異性鑒定 間接ELISA結(jié)果表明，單克隆抗體(雜交瘤細(xì)胞上清液)只與TDH的反應(yīng)時(shí)呈現(xiàn)陽性值，而與其他菌株的上清液分泌物中反應(yīng)時(shí)均呈現(xiàn)陰性值，即不發(fā)生交叉反應(yīng)，故由此判斷T9H4單克隆抗體具有良好的特異性(圖4)。

表1 TDH單克隆抗體效價(jià)測定Tab.1 The titers of monoclonal antibody against TDH

圖3 小鼠腹水純化電泳圖Fig.3 SDS-PAGE figure for purification of ascites from mice

圖4 TDH單克隆抗體特異性分析(間接ELISA法)Fig.4 The analysis of TDH monoclonal antibody specificity(indirect ELISA)

圖5 小鼠IgG濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Concentration standard curve of IgG

圖6 TDH單克隆抗體親和力曲線Fig.6 The curve of monoclonal antibody against TDH

2.7單克隆抗體免疫球蛋白亞類的鑒定 利用鼠源單克隆抗體亞型快速鑒定試劑盒檢測T9H4單克隆抗體蛋白亞型為IgG1，輕鏈屬Kappa型。

2.8單克隆抗體親和力的測定 抗體親和力的測定(非競爭性ELISA方法)：雙抗體夾心方法測得小鼠IgG純品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，根據(jù)此曲線得到單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體濃度為0.061 0 mg/ml;對單克隆抗體T9H4進(jìn)行了競爭性測定，分別用20、10和5 μg不同含量的純TDH抗原包被96孔板，根據(jù)3條單克隆抗體相對親和力曲線(圖6)并運(yùn)用公式 Ka=(n-1)/2(n［Ab’］t-［Ab］t)計(jì)算 3 條曲線的Ka值，最終以平均值計(jì)為該抗體的親和性常數(shù)，Ka=2.19 ×109L/mol。

3 討論

副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素TDH作為最主要的致病因子，對于廣大熱衷于海產(chǎn)品的民眾的食品安全衛(wèi)生而言直接產(chǎn)生了相當(dāng)大的負(fù)面作用，因此制備出特異性針對TDH的單克隆抗體有助于開發(fā)免疫學(xué)快速檢測方法。

本文首先提取純化了純度為95%以上的副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素TDH作為免疫源，通過小鼠腹腔先后進(jìn)行5次免疫，運(yùn)用常規(guī)間接ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞，采取有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆，最終獲得一株針對副溶血弧菌TDH高特異性、親和力、穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株T9H4。整個(gè)單克隆抗體的免疫制備過程，我們盡可能提高細(xì)胞融合率，用8-氮雜鳥嘌呤處理SP2/0細(xì)胞，并調(diào)整好骨髓瘤細(xì)胞的狀態(tài)，必要時(shí)可以采用通過注射到小鼠體內(nèi)，使其生長出實(shí)體瘤，然后再收集瘤細(xì)胞;同時(shí)在提取脾細(xì)胞時(shí)，必須將小鼠脾臟周圍的結(jié)締組織完全去除，減少其在融合后對雜交瘤細(xì)胞的生長影響與篩選的阻礙作用;除此之外，我們還額外增加了克隆的板數(shù)，以期更大可能地獲得目的抗體。

此外，我們對于TDH單克隆抗體進(jìn)行了初步鑒定。純化后的T9H4抗體效價(jià)高達(dá)1∶1 024 000;SDS-PAGE分析顯示其分子量約為146 kD，重鏈和輕鏈分別為50 kD和23 kD;其蛋白亞型屬于IgG1、輕鏈為Kappa型;均不與沙門氏菌、大腸桿菌、李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、非致病性副溶血弧菌(無TDH，含TLH)發(fā)生交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性，并伴隨有較高的親和力常數(shù)K=2.19×109L/mol，同時(shí)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性也相當(dāng)良好。

目前，國內(nèi)尚無有關(guān)副溶血弧菌TDH單克隆抗體制備的報(bào)道，因此本文著力制備并分析了TDH單克隆抗體特性，為之后更深入的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料與理論基礎(chǔ)。

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