李向紅 陳芳芳 黃成斌 余為一 (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036)

由傳染性法氏囊炎病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的IBD是雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBDV主要侵害3～12周齡雛雞或青年雞的法氏囊，嚴(yán)重感染可導(dǎo)致發(fā)病雞死亡;存活雞則因全身性免疫抑制，使之免疫能力下降，易感染其他傳染病。目前該病呈世界性分布，是危害養(yǎng)禽業(yè)的三大疫病之一。

IBDV屬雙RNA病毒科(Bimaviridae family)的雙RNA病毒屬(Avanbimavirus)?；蚪M包括A，B兩節(jié)段。A片段編碼VP2-4-3和VP5組成的多聚蛋白;其中VP2和VP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP4為病毒自身蛋白酶，而VP5只能在IBDV感染的細(xì)胞中被檢測(cè)［1］。B片段編碼 VP1蛋白，為 RNA依賴的RNA聚合酶。另有研究表明，VP2與病毒毒力和細(xì)胞嗜性有關(guān)［2］。迄今，在IBDV的抗原表位研究中，至少發(fā)現(xiàn)在VP2中存在3個(gè)構(gòu)象依賴性中和抗原表位，2個(gè)線性中和抗原表位，在VP3上也發(fā)現(xiàn)了2個(gè)線性的抗原表位［3-7］。但更多的IBDV的抗原表位序列有待進(jìn)一步研究。

自Smith［8］第一次成功地將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)以來(lái)，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于抗原檢測(cè)和模擬表位的研究領(lǐng)域［9-11］。該法是利用基因克隆技術(shù)將多肽編碼基因插入線性噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體外殼蛋白上。本研究以實(shí)驗(yàn)室制備保存的IBDV及VP2蛋白制備的單克隆抗體［12］作為靶分子，應(yīng)用噬菌體12肽庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得與單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體，通過(guò)序列測(cè)定和比對(duì)，分析其抗原模擬表位，為進(jìn)一步研究IBDV的抗原性質(zhì)和免疫特點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和耗材 噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)購(gòu)于New England Biolabs公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗M13單克隆抗體購(gòu)自GE Healthcare公司;96孔酶標(biāo)板購(gòu)自Coster公司。IBDV，VP2蛋白及3株IBDV單克隆抗體(H53，VP2單克隆抗體V1和V38)由本實(shí)驗(yàn)室保存，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2單克隆抗體的純化及其鑒定 采用辛酸-飽和硫酸銨法純化單克隆抗體腹水，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)其純度進(jìn)行鑒定。采用間接ELISA方法測(cè)定純化后單克隆抗體的效價(jià)。

1.3噬菌體肽庫(kù)的生物淘洗 將純化的抗IBDV單克隆抗體(100 μg/ml)包被于96孔酶標(biāo)板，4℃孵育過(guò)夜。參照噬菌體肽庫(kù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行第一輪淘洗，將淘洗后洗脫物加入到20 ml ER2738培養(yǎng)物中(菌體處于對(duì)數(shù)前期)進(jìn)行擴(kuò)增，滴度實(shí)驗(yàn)測(cè)定噬菌體的數(shù)量，然后依次按上述步驟進(jìn)行第2、3、4輪的親和篩選。加入的噬菌體量均為2×1011pfu，第2、3、4輪用于篩選的包被單克隆抗體濃度分雖為50、30和10 μg/ml，TBST 中 Tween-20 的濃度增至 0.5%，其它步驟與第一輪篩選相同。

1.4間接ELISA檢測(cè)噬菌體多肽對(duì)單抗的結(jié)合活性 將5 μg/ml的單抗100μl/孔包被96孔酶聯(lián)板，4℃過(guò)夜。2%牛血清白蛋白(BSA)封阻液，室溫振蕩1小時(shí)。0.1%TBST洗滌6次，拍干。分別加入經(jīng)四輪淘選后從平板上挑取的30個(gè)克隆擴(kuò)增液100 μl。室溫振蕩作用1小時(shí)，洗滌6次，拍干。加入1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗M13單克隆抗體100 μl，室溫振蕩結(jié)合1小時(shí)，TBST洗板六次，拍干，OPD底物緩沖液顯色5分鐘，加終止液100 μl后測(cè)定OD492值。單抗包被加原始肽庫(kù)作陰性對(duì)照，單抗包被加 TBS作空白對(duì)照，P/N≥2.1判為陽(yáng)性。

1.5競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定高親和力噬菌體 將3株單克隆抗體包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。以IBDV及VP2蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)抑制物，分別與對(duì)應(yīng)單克隆抗體篩出的陽(yáng)性噬菌體同時(shí)加入并作用60分鐘，洗滌，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗M13單克隆抗體孵育30分鐘后顯色。以單抗包被加TBST作空白對(duì)照，在492 nm處測(cè)A值。按照公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(1-加競(jìng)爭(zhēng)物A492nm值/未加競(jìng)爭(zhēng)物A492nm值)×100%。

1.6DNA序列測(cè)定及分析 將競(jìng)爭(zhēng)ELISA陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，取500 μl噬菌體擴(kuò)增液，提取其DNA送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNAStar軟件進(jìn)行多肽分析。

2 結(jié)果

2.1純化單克隆抗體腹水的鑒定及其效價(jià)測(cè)定

首先，采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法純化的3株單抗的純度。如圖1所示，這些純化的樣品在電泳中均出現(xiàn)2條帶，分別為IgG的輕鏈與重鏈(圖1)。應(yīng)用凝膠分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行光密度掃描，三株單克隆抗體的純度分別為99.5%、98.6%和99.1%。通過(guò)間接ELISA測(cè)定樣品效價(jià)，均達(dá)1.6×10-5。這些表明，經(jīng)處理的單克隆抗體達(dá)到較高的純度和活性，能夠保證親和篩選過(guò)程中與噬菌體的特異性結(jié)合。

2.2多輪淘洗獲得30株噬菌體 利用純化抗體從噬菌體肽庫(kù)中篩選具相應(yīng)抗原表位噬菌體株。為了篩選高親和力噬菌體，本研究采用逐步減少抗體包被量、縮短孵育時(shí)間和加大其洗脫強(qiáng)度，經(jīng)過(guò)4輪的淘選，回收率逐漸增大。表1結(jié)果表明，所淘選的噬菌體得到了選擇性的富集。

圖1 3株單克隆抗體純化的SDS-PAGE圖譜Fig.1 Three strains of purified McAb in SDS-PAGE

2.3間接ELISA鑒定噬菌體陽(yáng)性株 對(duì)獲得的高親和力噬菌體采用間接ELISA進(jìn)行鑒定，即從最后一輪淘洗和復(fù)制的3個(gè)針對(duì)不同單抗的噬菌體LB/IPTG/Xgal平板(＜100個(gè)噬菌斑/培養(yǎng)皿)上，分別隨機(jī)挑取藍(lán)色噬菌體斑進(jìn)行擴(kuò)增以進(jìn)行特異性結(jié)合鑒定。從30個(gè)樣品中得到22個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆(P/N≥2.1，圖2)。

2.4競(jìng)爭(zhēng)ELISA鑒定陽(yáng)性噬菌體株與相應(yīng)抗體的特異性結(jié)合 對(duì)上述22個(gè)陽(yáng)性株進(jìn)一步用競(jìng)爭(zhēng)ELISA縮小其篩選范圍。結(jié)果，有14個(gè)噬菌體株的抑制率達(dá)50%以上。其中50% ～60%有8個(gè);61%～70%有6個(gè)。IBDV及VP2抗原蛋白能夠抑制所篩選的噬菌體與特異性抗體結(jié)合的結(jié)果表明，這些噬菌體展示的多肽含有IBDV抗原的模擬表位，與相應(yīng)抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合。

表1 特異性單克隆抗體多輪篩選和富集噬菌體Tab.1 Enrichment and multi-biopanning of phage by specific mAbs

圖2 ELISA檢測(cè)噬菌體克隆與單克隆抗體結(jié)合力Fig.2 Determination of the binding of phage clones to McAb by ELISA

表2 與單抗結(jié)合陽(yáng)性的噬菌體克隆的氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequences of the positive phage clones binding with McAbs

2.5測(cè)序、序列比對(duì)和分析 為確定這些競(jìng)爭(zhēng)抑制陽(yáng)性的噬菌體展示的多肽序列，將最后篩選的14株噬菌體 (5株H53、4株V1和5株V38)DNA進(jìn)行測(cè)序，并用DNAStar軟件分析出其12肽序列(表2)。得出 H53模擬表位的共有序列為 XILRXXXXXXHM，V1模擬表位的共有序列為RXLRLXXPIXQX，V38模擬表位的共有序列為XRXXRXXRRPRP(X為任意氨基酸)。進(jìn)一步將這些序列分別與GenBank中IBDV多聚蛋白(GenBank登錄號(hào)：AAC06016.1)和VP2蛋白(GenBank登錄號(hào)：AAV88108.1)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，H53單克隆抗體篩選出來(lái)的共有序列ILR與多聚蛋白的921～923位氨基酸一致。V1篩選出來(lái)的共有序列RLXXPI與VP2蛋白173～178位氨基酸高度同源，但沒(méi)有連續(xù)三個(gè)及以上氨基酸殘基一致。V38篩選出來(lái)的共有序列RPR與VP2蛋白的196～198位氨基酸一致。3個(gè)表位序列與IBDV結(jié)構(gòu)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列沒(méi)有連續(xù)3個(gè)以上的氨基酸殘基相同，推測(cè)是構(gòu)象依賴型表位。在14個(gè)多肽中R、P、L的含量較高，推測(cè)其為構(gòu)成IBDV表位序列的關(guān)鍵氨基酸。

3 討論

3.1單克隆抗體純化方法的選擇 靶分子的純度及活性將直接影響與肽庫(kù)中噬菌體的特異性結(jié)合，是篩選高質(zhì)量噬菌體的前提。本研究采用辛酸-飽和硫酸銨法純化單抗，其生物活性及回收率較DEAE-纖維素層析高［13］。本研究所用3株單抗的亞類(lèi)均為IgG2b，適合用辛酸-飽和硫酸銨法提純。圖1的電泳圖表明，純化的單克隆抗體純度較高，而且經(jīng)測(cè)定其效價(jià)達(dá)1.6×10-5。總之，采用該方法提純的單克隆抗體，可滿足噬菌體12肽庫(kù)篩選對(duì)靶分子的要求。

3.2抗原表位分析 本研究將H53及V1，V38單克隆抗體作為靶分子對(duì)噬菌體12肽庫(kù)進(jìn)行親和篩選，通過(guò)逐輪降低抗體包被濃度，縮短孵育時(shí)間及提高洗滌強(qiáng)度來(lái)獲得高特異性及高親和力的噬菌體克隆。四輪淘洗后，通過(guò)陽(yáng)性鑒定及競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)挑選出能被競(jìng)爭(zhēng)性抑制的噬菌體克隆，測(cè)序分析后獲得三個(gè)表位序列。H53篩選的模擬表位序列位于多聚蛋白921～923處，推測(cè)H53篩選出的抗原模擬表位位于VP3蛋白上。其中短肽序列KILRIPLIINHM重復(fù)出現(xiàn)3次且與多聚蛋白的921～952位氨基酸同源性較高，推測(cè)構(gòu)象表位的氨基酸位于921～952區(qū)域內(nèi)。V38篩選出來(lái)的表位位于VP2蛋白的196～198位氨基酸處，軟件分析可知此區(qū)域氨基酸抗原指數(shù)較高，RPR可能就是IBDV抗原表位的關(guān)鍵的氨基酸。V1篩選出來(lái)的多肽共有序列中RLXXPI序列與VP2蛋白173-178位氨基酸同源性達(dá)60%，但沒(méi)有連續(xù)3個(gè)及以上的氨基酸殘基一致，推測(cè)構(gòu)象型表位中R、L、P、I是構(gòu)成抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。也可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選用的是噬菌體12肽庫(kù)，多肽段較長(zhǎng)，使淘選到的模擬表位在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與IBDV結(jié)構(gòu)蛋白一致的可能性降低。3個(gè)模擬表位序列中堿性氨基酸含量較豐富，即使模擬表位與真實(shí)表位的氨基酸序列不完全一致，也可以推測(cè)出IBDV的表位序列氨基酸跟堿性氨基酸有關(guān)。

3.3應(yīng)用噬菌體肽庫(kù)的局限性 與其他研究抗原表位的方法相比，應(yīng)用噬菌體肽庫(kù)篩選的優(yōu)點(diǎn)是可以模擬抗體與抗原表位氨基酸殘基之間的相互作用。噬菌體展示技術(shù)不僅可以模擬線性結(jié)構(gòu)和一定的空間結(jié)構(gòu)，而且還可以模擬被修飾后的蛋白質(zhì)抗原表位。但是，該方法也存在局限性。一是肽庫(kù)的庫(kù)容量小，目前常用的噬菌體肽庫(kù)中不同多肽序列的數(shù)量一般限制在109，可能缺乏與病毒抗原表位一致的多肽序列。二是有些肽段由于疏水基團(tuán)等因素影響蛋白的折疊而不能在噬菌體正確表達(dá)，使得展示在噬菌體外殼蛋白上的多肽數(shù)量受到限制，一些與靶分子親和力較強(qiáng)的多肽也可能因此而丟失，導(dǎo)致篩選分析后得不到正確的抗原表位序列。

1 Mundt E，Beyer J，Muller H.Identification of a novel viral protein in infectious bursal disease virus infected cells［J］.J Gen Virol，1995;76(2)：437-443.

2 Brandt M，Yao K，Liu M et al.Molecular determinants of virulence，cell tropism，and pathogenic phenotype of infectious bursal disease virus［J］.J Virol，2001;75(24)：11974-11982.

3 Yamaguchi T，Lwata K，Kobayashi M et al.Epitope mapping of capsid proteins VP2 and VP3 of infectious bursal disease virus ［J］.Arch Virol，1996;141(8)：1493-1507.

4 Cui X L，Nagesha H S，Holmes I H.Mapping of conformational epitopes on capsid protein VP2 of infectious bursal disease virus by fd-tet phage display［J］.J Virol Meth，2003;114(1)：109-112.

5 Cui X L，Nagesha H S，Holmes I H.Identification of crucial residues of conformational epitopes on VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage display［J］.J Virol Meth，2003;109(1)：75-83.

6 Wang X N，Zhou J Y，Zhang G P.Identification of neutralizing epitopes on the VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage displayed heptapeptide library screening and synthetic peptide mapping［J］.Viral Immunol，2005;18(3)：549-557.

7 Deng X Y，Gao Y L，Gao H L et al.Antigenic structure analysis of VP3 of infectious bursal disease virus［J］.Virus Research，2007;129(1)：35-42.

8 Smith G P.Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface［J］.Science，1985;228(4705)：1315-1317.

9 王子曄，馮 娟，馬雪梅.利用噬菌體肽庫(kù)篩選與HIV-1p24抗原結(jié)合的多肽［J］.中國(guó)生物工程雜志，2011;31(5)：104-107.

10 Scott J K，Smith G P.Searching for peptide ligands with an epitope library［J］.Science，1990;249(1)：386-390.

11 王細(xì)文，梁 平，韓本立.應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)研究蛋白質(zhì)抗原表位的進(jìn)展［J］. 免疫學(xué)雜志，2000;16(4)：313-314.

12 黃成斌，潘 玲，余為一.兩種來(lái)源的IBDV抗原制備單克隆抗體的比較［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010;38(28)：15679-15680，

15682.

13 周 玉，李巖松，潘風(fēng)光et al.小鼠腹水IgG類(lèi)單克隆抗體純化方法的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006;10(1)：14-16.