楊 倩 曹海鵬 和永杏 姜有聲 呂利群

(上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海201306)

草魚出血病是由草魚呼腸孤病毒(Grass Crap Reovirus，GCRV)引起的病毒性疾病，傳染性強，對草魚的致死率極高，是危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)最嚴重的疾病之一［1］。因此，采用快速有效的手段檢測草魚呼腸孤病毒對診斷草魚出血病具有重要的意義。鑒此，本實驗在制備了對GCRV具有良好中和能力的抗VP7多抗血清的基礎上［2］，進一步篩選了最佳分泌外殼蛋白VP7單克隆抗體的雜交瘤細胞，制備了外殼蛋白VP7的單克隆抗體，并對該單克隆抗體的亞型、靈敏度、特異性及臨床檢測效果等免疫學特性進行了分析，為GCRV的ELISA檢測及草魚出血病的臨床診斷奠定了重要的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 草魚呼腸孤病毒GDV004株，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供;疑似患草魚出血病的草魚病樣(1～14)，分別于2011年6～8月采集自江西南昌地區(qū)和廣東廣州地區(qū);BALB/c小鼠，購自上海動物實驗中心;鼠源性單克隆抗體亞型快速鑒定試劑盒，購于Sigma公司;Bradford蛋白質定量檢測試劑，購于生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 草魚呼腸孤病毒外殼蛋白VP7單克隆抗體的制備與篩選、亞型鑒定及純化 參照胡鯤等［3］的方法進行單克隆抗體的制備，然后通過ELISA法篩選能夠分泌外殼蛋白VP7單克隆抗體的雜交瘤細胞株(其中OD450值大于0.25且大于陰性對照(NC)值的兩倍即為陽性)，并進一步采用GCRV病毒液作為包被原，通過 ELISA法、Western blot法(以含pGEX-4t-3質粒的大腸桿菌及CIK細胞作為陰性對照)篩選出特異性強、檢測限低的最佳雜交瘤細胞株［2，3］。采用鼠源單克隆抗體快速檢測亞型檢測試劑盒對該單克隆抗體進行亞型鑒定，并制備BALB/c小鼠腹水，采用辛酸-飽和硫酸銨法進行單克隆抗體的純化，采用Bradford蛋白質定量檢測試劑測定抗體濃度［4］。

1.3 臨床檢測效果的測定 參照劉永奎等［5］的方法對疑似患草魚出血病的草魚病樣進行處理;ELISA法檢測草魚病樣陽性(選擇 ELISA檢測GCRV病毒液后 OD450值為1時的抗體濃度)，以Seng等［6］的RT-PCR法對草魚病樣組織上清過濾液中草魚呼腸孤病毒的檢測結果進行驗證。

2 結果

2.1 草魚呼腸孤病毒外殼蛋白VP7單克隆抗體的制備與篩選、亞型鑒定及純化 共篩選12株能夠分泌外殼蛋白VP7單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別依次暫命名為MA1～MA12，其中MA3產(chǎn)生的單克隆抗體的效價最高，稀釋 8×105倍后的 OD450為1.656，純化的抗體濃度為3.77×103μg/ml，抗體效價為1∶5 120;對病毒滴度為50 TCID50的GCRV的最低檢測限為0.737 μg/ml;能夠特異性識別原核表達的外殼蛋白VP7和感染GCRV的CIK細胞中的外殼蛋白VP7，對GST標簽蛋白也無特異性反應，且條帶清晰、背景無雜帶、特異性強(圖1);經(jīng)鼠源單克隆抗體亞型快速鑒定試劑盒亞型鑒定，該抗體亞型為IgG2b。

2.2 草魚呼腸孤病毒外殼蛋白VP7單克隆抗體臨床檢測效果的測定臨床試驗ELISA及RT-PCR結果見圖2。由圖可見，ELISA法與RT-PCR法對草魚病樣上清過濾液中草魚呼腸孤病毒的檢測具有一致性。

圖1 MA3產(chǎn)生的VP7單克隆抗體的Western blot結果Fig.1 Western blot results of MA3 Mab

圖2 ELISA及RT-PCR法對草魚病樣組織上清過濾液中草魚呼腸孤病毒的檢測Fig.2 GCRV detection supernatant filtrates of samples of diseased grass carp orgen samples by ELISA and RT-PCR

3 討論

單克隆抗體在水產(chǎn)動物病原檢測方面已經(jīng)得到了廣泛應用。然而，從現(xiàn)有文獻資料來看，國內尚未建立草魚呼腸孤病毒免疫學檢測方法。本實驗制備了草魚呼腸孤病毒外殼蛋白VP7的單克隆抗體，并分析了其免疫學特性，為今后建立更加靈敏、準確、特異性強的快速檢測草魚呼腸孤病毒方法奠定了堅實的基礎。

目前，國內外大多數(shù)研究者對草魚呼腸孤病毒抗血清(抗體)及其特性進行了大量研究。例如，方勤等［7］獲得了草魚呼腸孤病毒GCRV873抗體，證實其能夠有效地中和草魚呼腸孤病毒991病毒顆粒，形成抗原抗體免疫復合物;卲健忠等［8］制備了草魚呼腸孤病毒的兔GCHV抗血清及鼠GCHV抗血清，其抗體效價分別為1∶256和1∶32，對草魚呼腸孤病毒檢測的靈敏度比SPA-CoA法和常規(guī)ELISA法分別提高10倍和20倍。而本實驗對草魚呼腸孤病毒外殼蛋白VP7的單克隆抗體的檢測結果相當于卲健忠等［8］報道的草魚呼腸孤病毒抗血清抗體效價20倍，這與單克隆抗體具有高度特異性及均質性、含量高且成分單一有關。

隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，國內已經(jīng)相繼建立了多種草魚呼腸孤病毒PCR檢測方法，并廣泛應用于草魚呼腸孤病毒的常規(guī)檢測。因此，本實驗采用RT-PCR法對草魚病樣上清過濾液中的草魚呼腸孤病毒進行了檢測，以確定基于外殼蛋白VP7單克隆抗體的ELISA法對草魚呼腸孤病毒檢測的特異性與準確性。實驗結果表明，基于外殼蛋白VP7單克隆抗體的ELISA法與RT-PCR法對草魚病樣上清過濾液中草魚呼腸孤病毒的檢測結果完全一致，可用于草魚呼腸孤病毒的常規(guī)檢測。

1 方 勤，朱作言.水生呼腸孤病毒研究進展［J］.中國病毒學，2003;18(1)：82-88.

2 He Y，Yang Q，Xu H et al.Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protein VP7 and its vaccine potential［J］.African J Microbio Research，2011;5(13)：1643-1648.

3 胡 鯤，黃宣運，姜有聲 et al.環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備及免疫學特性分析［J］.中國免疫學雜志，2010;26(7)：538-543.

4 馮仁青，郭振泉，宓捷波.現(xiàn)代抗體技術及其應用［M］.北京：北京大學出版社，2006：47-50.

5 曾偉偉，王 慶，劉永奎 et al.一株草魚呼腸孤病毒弱毒株的分離、鑒定及免疫原性初步分析［J］.水生生物學報，2011;35(5)：790-796.

6 Seng E K，F(xiàn)ang Q，Lama T J et al.Development of a rapid，sensitive and specific diagnostic assay for fish.Aquareovirus based on RT-PCR［J］.J Virolo Meth，2004;118：111-122.

7 方 勤，肖調義，丁清泉 et al.草魚呼腸孤病毒新分離株(GCRV991)的病毒學特性分析［J］.中國病毒學，2002;17(2)：178-181.

8 卲健忠，項黎新，李亞南 et al.應用Dot-ELISA技術檢測草魚出血病病毒的研究［J］. 水產(chǎn)學報，1996;20(1)：6-12.