董姍姍 王 虹 賀 瀟 李忱偉 董 杰 姜 慧 袁 軍 何於娟 李岱容

(重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶400016)

肺炎鏈球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)是肺炎鏈球菌的重要毒力因子，是一種氨基酸序列高度保守的52 kD的可溶性蛋白。Ply是膽固醇依賴的溶細胞素家族成員，在靶細胞膜上通過寡聚體化而形成一種大的環(huán)形穿膜孔，所形成的寡聚物與毒素的溶細胞活性以及過度的細胞調(diào)節(jié)活動有關(guān)［1］。在肺炎鏈球菌與宿主細胞的相互作用中，肺炎鏈球菌所釋放的Ply可直接殺傷靶細胞或?qū)е掳屑毎蛲觥?/p>

固有免疫是生物在長期進化中逐漸形成的，是機體抵御病原體入侵的第一道防線。細胞凋亡是宿主對病原菌產(chǎn)生固有免疫反應的表現(xiàn)之一，已有研究表明，在肺炎鏈球菌引起的腦膜炎模型中，溶血素可以誘導神經(jīng)元細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡，從而加重對宿主的損害。樹突狀細胞、單核-巨噬細胞、中性粒細胞等是主要的固有免疫細胞。目前大多數(shù)研究主要針對Ply誘導樹突狀細胞、耳蝸毛細胞及神經(jīng)元細胞凋亡及死亡［2-4］，而Ply對小鼠單核巨噬細胞增殖和凋亡的研究鮮有報道。本文通過研究Ply對小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株RAW264.7細胞體外生長的影響，探討Ply誘導單核巨噬細胞凋亡的機制，為進一步研究Ply觸發(fā)宿主瞬時和早期固有免疫應答機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株RAW264.7購自中國科學院上海細胞生物學研究所;純化的Ply蛋白由本實驗室表達［5］;DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清均為美國Hyclone公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)均為美國Sigma公司產(chǎn)品;Annexin V/FITC試劑盒、Caspase試劑盒購自Biovision公司;Bax、Bcl-2、Fas多克隆抗體、即用型免疫組化SABC試劑盒、鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑購自武漢博士德生物工程有限公司;蘇木素染液購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)中，37℃，相對濕度95%，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，注意觀察細胞生長狀態(tài)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2細胞形態(tài)觀察 將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成密度為1×105個/ml的單細胞懸液，取5 ml接種于培養(yǎng)瓶中，待貼壁后，加入1 μg/ml Ply蛋白，培養(yǎng)24小時后，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.3MTT增殖實驗 取對數(shù)生長期RAW264.7細胞配制成密度為1×104個/ml細胞懸液，接種于96孔板，每孔加200 μl，常規(guī)培養(yǎng)24小時待細胞貼壁后加入不同濃度Ply蛋白(終濃度為0.1、0.5、1、2.5、5 μg/ml)，另設加入等量培養(yǎng)液的對照組，每個實驗組做5個重復孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96小時后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時，用1 ml注射器吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μl DMSO，振蕩使結(jié)晶溶解后，用酶標儀測定不同作用時間下細胞的吸光度(A492)，實驗重復5次，計算Ply對細胞生長的影響。細胞增殖 抑 制 率 (%) =(1-A藥物/A對照) ×100%。IC50=e{lg最大劑量-［lg(最大劑量/相鄰劑量)］［陽性反應率之和-(3-最大陽性反應率-最小陽性反應率)/4］}。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙標法檢測凋亡細胞百分率 以0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，接種于 6 孔板，設陰性對照組，0.5 μg/ml和 1 μg/ml Ply蛋白組，貼壁后加入相應蛋白，置于37℃、5%CO2孵育1小時和3小時后收集各組細胞參照說明書進行操作，Annexin V-FITC和PI雙染后流式細胞儀檢測。

1.2.5分光光度法對Caspase-3、8、9進行活性檢測 收集 1 μg/ml Ply蛋白作用 24小時后的RAW264.7細胞，PBS洗2次，加入50 μl Lysis Butter和0.5 μl DTT，置冰上作用40分鐘，離心收集上清液，加入 50 μl 2 × Reaction Butter和 0.5 μl DTT，再分別加入5 μl Caspase-3、8、9底物，37 ℃避光孵育4小時，用酶標儀測定405 nm波長下的吸光度值(A405nm)，通過與標準曲線對比，得到各組的Caspase-3、8、9 相對酶活力單位。

1.2.6免疫細胞化學法檢測Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表達 收集1 μg/ml Ply蛋白作用24小時后的RAW264.7細胞，PBS洗滌3遍;4%多聚甲醛25℃固定細胞爬片30分鐘，加入新鮮配制的3%H2O2，室溫孵育10分鐘，PBS洗3遍，每次2分鐘;滴加5%BSA封閉液，室溫封閉30分鐘，甩去多余液體;滴加1∶200稀釋的 Bax、Bcl-2、Fas抗體，同時用 PBS代替一抗做陰性對照，4℃過夜;37℃孵育1小時，滴加生物素標記二抗，37℃孵育30分鐘，PBS洗3遍，每次2分鐘;滴加試劑SABC，37℃孵育20分鐘，PBS洗3遍，每次2分鐘;DAB顯色，滴加100 μl新鮮配制的DAB顯色工作液，室溫顯色3～10分鐘，顯微鏡下控制反應時間，使用蒸餾水終止顯色;蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片;晾干后，顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。Nikon 80i顯微鏡計算機圖像分析軟件key-NIS-Elimements BR3.2選取10個高倍視野(×400倍)，計算每個視野陽性細胞的光密度值及平均光密度值，并計算比值：比值=處理組平均光密度值/對照組平均光密度值，比值反映蛋白 Bax、Fas、Bcl-2表達水平的高低。

1.3統(tǒng)計學方法 本實驗所有數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗分析，使用SAS8.0統(tǒng)計軟件進行分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1倒置顯微鏡觀察RAW264.7細胞形態(tài)改變 用1 μg/ml Ply蛋白處理RAW264.7細胞24小時后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變，結(jié)果顯示，對照組細胞緊密排列，與培養(yǎng)瓶壁牢牢粘附，部分細胞伸出觸角;Ply蛋白處理組細胞數(shù)量顯著減少，大多數(shù)細胞未貼壁，部分細胞發(fā)生皺縮變小變圓，核質(zhì)濃縮，細胞增殖明顯受抑(圖1)。

2.2Ply蛋白抑制 RAW264.7細胞生長 0.1、0.5、1、2.5、5 μg/ml Ply 蛋白分別作用于 RAW264.7細胞后，MTT檢測Ply對細胞生長的影響。隨著作用時間的延長，對細胞的生長抑制作用逐漸增強，具有明顯的時效和量效關(guān)系(P＜0.01)，見圖2。

2.3流式細胞儀檢測RAW264.7細胞凋亡率 流式細胞儀分析結(jié)果顯示，0.5 μg/ml Ply蛋白處理RAW264.7細胞1小時和3小時的凋亡率分別為25.52%和 40.86%，1 μg/mlPly蛋 白 處 理RAW264.7細胞1小時和3小時的凋亡率分別為32.90%和51.56%，隨著Ply蛋白濃度的增加和處理時間的延長，RAW264.7細胞凋亡率逐漸增加，與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見圖3。

圖1 倒置顯微鏡觀察RAW264.7細胞形態(tài)改變(×200)Fig.1 Cell morphology changes observed by inverted microscope(×200)

圖2 Ply蛋白對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.2 Effect of Ply on RAW264.7 proliferation

2.4Caspase-3、8、9 的活性檢測 1 μg/ml Ply 蛋白處理RAW264.7細胞24小時，Caspase-3、8、9活性均比對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

2.5凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Fas、Bcl-2的表達 Bax、Fas、Bcl-2蛋白主要定位于細胞漿和細胞膜，陽性染色呈棕黃色顆粒。結(jié)果顯示，Bax、Fas表達較對照組增強，Bcl-2表達減弱(圖5)，圖像分析軟件key-NIS-Elimements BR3.2打分顯示變化有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，見表1。

圖3 不同濃度Ply蛋白作用1小時和3小時后對RAW264.7細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of Ply with different concentrations and different incubation times(1 h and 3 h)on RAW264.7 apoptosis respective

圖4 Ply蛋白作用24小時對RAW264.7細胞Caspase活性的影響Fig.4 Effect of Ply on Caspase activity of RAW264.7(24 h)

圖5 RAW264.7細胞Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表達(×400)Fig.5 Expressions of Bax，F(xiàn)as and Bcl-2 of RAW264.7(×400)

表1 RAW264.7細胞Bax、Fas、Bcl-2蛋白表達的圖像分析Tab.1 Image analysis of Bax，F(xiàn)as and Bcl-2 proteins expression of RAW264.7

3 討論

溶血素(Pneumolysin，Ply)是肺炎鏈球菌一個重要的毒力因子，具有溶細胞活性、補體激活和誘導細胞凋亡等多種生物學功能［1-4］，但其具體在細菌感染宿主的哪些環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，目前尚不十分清楚。

凋亡是細胞的一種程序性死亡，在生理情況下是機體組織清除衰老和受損細胞的一種自殺方式，作用在于調(diào)節(jié)細胞增殖和死亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但當機體受到細菌等病原體刺激時，凋亡就成為宿主對病原菌產(chǎn)生先天性免疫反應的表現(xiàn)之一。當病原體對機體的刺激達到一定強度，正常細胞凋亡過度，就會對機體造成損害。已有研究表明，在肺炎鏈球菌引起的腦膜炎模型中，溶血素可以誘導神經(jīng)元細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡，從而加重對宿主的損害［4］。而肺泡巨噬細胞在小鼠肺部含量非常豐富，并且在小鼠對肺炎鏈球菌的天然免疫中起著重要的作用。有研究顯示Ply可誘導肺泡巨噬細胞凋亡［6］，但其具體分子機制尚不十分清楚。

本研究通過倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)觀察，顯示Ply蛋白處理組細胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)學改變，細胞增殖明顯受抑;MTT增殖實驗表明不同濃度的Ply蛋白分別作用于RAW264.7細胞后，隨著作用時間的延長，對細胞的生長抑制作用逐漸增強，具有明顯的時效和量效關(guān)系，表明Ply蛋白可以明顯抑制RAW264.7細胞的生長;流式細胞儀測定凋亡率也提示隨著Ply濃度和處理時間的延長，RAW264.7細胞的凋亡率顯著增加;以上結(jié)果均證實Ply蛋白在體外可引起RAW264.7細胞的凋亡。

對于哺乳動物來說，細胞凋亡的主要途徑有兩條：死亡受體/Fas途徑和線粒體途徑。不管是死亡受體途徑還是線粒體途徑，都是由Caspase的活化而啟動的［7］。

Caspase是一類在凋亡的啟動過程中起關(guān)鍵作用的半胱氨酸家族蛋白酶，其中Caspase-8介導死亡受體/Fas途徑;Fas蛋白是腫瘤壞死因子受體超家族成員，它主要是與FasL蛋白結(jié)合激活Caspase-8，引起細胞凋亡，這一通路即為死亡受體途徑［7-9］。Caspase-9介導線粒體途徑，Bcl-2家族蛋白主要調(diào)控線粒體途徑，包括促進凋亡的Bax等蛋白和抑制凋亡的 Bcl-2等蛋白［10-12］。Caspase-3是Caspase-8和Caspase-9共同的下游分子。

RAW264.7細胞的溶血素蛋白處理組與對照組相比，處理組細胞的 Caspase-3、8、9活性均增高，Bax、Fas表達增高，Bcl-2表達降低。Caspase-8與Fas表達增高，提示Ply誘導RAW264.7細胞凋亡有經(jīng)過Fas途徑;Caspase-9與Bax表達增高，Bcl-2表達降低，說明也有線粒體途徑的激活。兩條途徑的激活都使得下游分子Caspase-3表達升高。因此我們認為死亡受體/Fas途徑和線粒體途徑共同參與了Ply誘導的RAW264.7細胞凋亡。

綜上所述，Ply可以誘導RAW264.7細胞的凋亡，誘導凋亡的機制可能是通過死亡受體/Fas途徑和線粒體途徑雙重機制的介導加以實現(xiàn)，具體機制有待進一步研究。

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