吳少輝，劉光明

（大理學(xué)院藥學(xué)院，云南 大理 671000）

蛋白質(zhì)在細(xì)胞和生物體的生命活動過程中（包括催化代謝反應(yīng)、物質(zhì)運轉(zhuǎn)、興奮的傳導(dǎo)、生長發(fā)育的控制等）起著重要的作用，因此，蛋白質(zhì)是生命科學(xué)極為重要的研究對象。蛋白質(zhì)的分離純化是蛋白質(zhì)研究中不可缺少的環(huán)節(jié)，只有了解蛋白質(zhì)的分子量、溶解性、等電點以及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，才能達(dá)到有效分離。

1 基于分子大小差異的分離技術(shù)

1.1 凝膠層析

凝膠層析又稱為凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析，是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小差異分離混合物的方法。由于該法上樣量有限，常用在純化的最后一步，并與其他分離方法（如離子交換[1]）組合使用。分離過程中，在保證原有生物活性的基礎(chǔ)上考慮裝柱、流速、洗脫液的選擇以及其他影響因素，最終確定合適的分離條件[2]。張及祿等[3]采用葡聚糖凝膠50（Sephadex G－50）等層析材料從白山巖棲蝮蛇蛇毒中分離純化出小分子多肽Saxis。張勇等[4]通過凝膠層析分離家蠅幼蟲血淋巴，得到了對真菌有抑制作用的組分。羅輕蕾等[5]通過硫酸銨沉淀和Sephadex G－200凝膠層析結(jié)合的方法，分離純化出美國紅魚血清免疫球蛋白。

1.2 超濾

超濾法是利用加壓膜分離技術(shù)，在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制薄膜，大分子溶質(zhì)滯留，從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化。該法操作簡便、成本低廉、試驗條件溫和，不需加熱，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相變化、pH變化，因而可以防止生物活性物質(zhì)的變性、失活和自溶[6]。張秀媛等[7]研究了超濾法分離純化酪蛋白糖巨肽（CGMP）的條件，得到的最佳條件是在室溫下，壓差為0.02MPa，濃縮比為8。

1.3 透析

透析是利用小分子經(jīng)過半透膜擴散到水（或緩沖液）的原理，將無機鹽等小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)，常和鹽析、鹽溶等方法聯(lián)合使用。肖桂秀[8]通過凝膠色譜法、透析法和乙醇沉淀法對羚羊角塞水提液中的蛋白質(zhì)、氨基酸等進行分離，透析結(jié)果表明，大的蛋白質(zhì)分子和小的氨基酸分子得到初步分離。李任強等[9]根據(jù)蚯蚓體內(nèi)血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)的特性與分布狀態(tài)，采用了雙水相萃取等工藝，分離純化了生物態(tài)含鐵蛋白質(zhì)，獲得了高純度的蚯蚓含鐵蛋白。

2 基于溶解度差異的分離純化技術(shù)

2.1 等電點法

等電點沉淀法是利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低且各種蛋白質(zhì)等電點不同的特點進行分離的方法。徐律等[10]利用等電點法在魚糜漂洗水中提取魚蛋白，提取率達(dá)83.33％，該法具有操作簡單，提取率高等優(yōu)點。陳申如等[11]用酸法提取鰱魚魚肉蛋白質(zhì)，最適pH為2.39，該方法提取的鰱魚肉蛋白質(zhì)無腥味，色澤潔白，產(chǎn)率高。

2.2 溶劑法

溶劑提取法包括水溶液提取法和有機溶劑提取法，其中緩沖溶液對蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，最為常用；而乙醇、丁醇和丙酮等有機溶劑具有一定的親水性和較強的親脂性，主要用于一些脂質(zhì)結(jié)合較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶。其中乙醇提取法溶解性能較好、溶出的水溶性雜質(zhì)少、可回收反復(fù)利用。丁醇在一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶提取中更加優(yōu)越，溶解脂的能力強，兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活[12]。

2.3 雙水相萃取法

雙水相萃取技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)。它把兩種聚合物與一種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不溶性形成兩相，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有操作條件溫和、處理量大、易連續(xù)操作等優(yōu)點，同時克服了常規(guī)萃取有機溶劑對生物物質(zhì)的變性作用，在粗提過程中保持了生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等優(yōu)勢[13－14]。該技術(shù)現(xiàn)已成功地應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)、抗生素微生物離子、電泳分離氨基酸等。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液pH、離子強度、鹽類型及濃度的影響[15]。劉楊等[16]以聚乙二醇（PEG）/硫酸鈉雙水相體系，經(jīng)一次萃取，從鈍頂螺旋藻（Spirulinaplatensis）細(xì)胞破碎液中富集分離得到藻藍(lán)蛋白。

反膠團萃取是指膠團內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團對外界有機溶劑的屏蔽作用，實現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和分離。該技術(shù)具有選擇性高、萃取過程簡單，正萃、反萃同時進行，能有效防止大分子失活、變性。其不足之處包括：普通離子型表面活性劑可能對產(chǎn)品產(chǎn)生污染；常用的離子型表面活性劑容易造成蛋白質(zhì)的變性和失活，雖然活性損失較少[17－18]。其影響因素主要包括表面活性劑種類以及濃度、離子強度、助表面活性劑、水相pH和溫度等[19]。反膠團萃取法還可提取蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和多肽。劉俊果等[20]利用反膠團萃取技術(shù)分離純化了新型溶栓藥物納豆激酶。

2.4 鹽溶法及鹽析法

許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無機鹽則溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶；而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)又會自動析出，該現(xiàn)象稱為鹽析。鹽溶和鹽析主要是通過影響蛋白質(zhì)分子表面的電荷而分離、純化蛋白質(zhì)。黃雄偉[21]報道，提取黃粉蟲蛋白質(zhì)的最佳工藝條件是氯化鈉0.5％，提取溫度50℃，液固比8∶1（體積質(zhì)量比），提取時間3h，蛋白質(zhì)沉淀pH=4.8。

鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一，常用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽。硫酸鈉具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、溶解度大等優(yōu)點，現(xiàn)在所指的鹽析法實際上多為硫酸銨鹽析法。該法受蛋白質(zhì)濃度、離子強度、鹽的性質(zhì)、pH及溫度等因素影響。李媛等[22]在家蠶絲素RGD融合蛋白的鹽析純化工藝研究中，得到的最優(yōu)純化條件為pH=8，硫酸銨在溶液中的飽和度為20％，室溫。

上述兩種方法分離純化蛋白質(zhì)后，都要采用凝膠過濾或透析除鹽[22]。

3 基于電荷不同的分離技術(shù)

3.1 離子交換層析

離子交換層析是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，目前已成為蛋白質(zhì)分離純化最常用的手段。離子交換層析以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物質(zhì)的衍生物為載體，在某一pH條件下，這些載體帶有正電荷或負(fù)電荷，當(dāng)待分離蛋白質(zhì)分子通過載體時，離子交換使蛋白質(zhì)分子分離純化。胡鵬等[23]通過DEAE－Sepharose－FF瓊脂糖凝膠離子交換層析法，對牛背最長肌中鈣激活酶進行了分離純化，并確定了最佳分離條件。

3.2 電泳技術(shù)

電泳技術(shù)作為分離純化蛋白質(zhì)的手段之一，無論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，都是分離度極高的分離方法，可分為變性電泳、常規(guī)電泳、等電聚焦電泳和毛細(xì)管電泳。獲得分離的蛋白質(zhì)，均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進行序列分析。吳序櫟等[24]通過十二烷基硫酸鈉 －聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離雞蛋的蛋白質(zhì)組分，采用免疫印跡方法鑒定過敏原，通過離子交換層析對雞蛋主要過敏原進行了初步純化。

4 基于對配體親和力差異的分離技術(shù)

親和層析是一種以樣品的生物活性為依據(jù)的分離技術(shù)。分析膜蛋白方法是利用蛋白質(zhì)能和某些專一分子可逆結(jié)合的特性而發(fā)展起來的層析技術(shù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過層析柱時，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結(jié)合，不被吸附的無關(guān)成分則可隨流出液通過柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開，而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強的底物衍生溶液洗脫目標(biāo)蛋白，即可脫離層析柱上的載體。1983年Anastasi等[25]采用親和層析方法，首次在雞蛋清中分離得到了兩種不同 PI值（6.5和5.6）的蛋白質(zhì)。

5 基于選擇性吸附差異的分離方法

疏水層析是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特性進行分離。在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會與疏水配基相結(jié)合，其他的雜質(zhì)蛋白則無此種性質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)初步分離。該方法具有使蛋白質(zhì)變性、僅適合部分蛋白質(zhì)等缺點。吳銀飛等[26]采用疏水作用層析法純化小鼠腹水來源的抗乙肝核心抗原（HBeAg）單克隆抗體（mAb），并對分離條件進行了優(yōu)化。

6 其他方法

反相高效液相色譜法是一種以疏水作用為基礎(chǔ)的色譜分離法，具有分辨率高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)及多肽的分離分析中得到了極其廣泛的應(yīng)用。

分子印跡是一種識別聚合物特殊結(jié)合位點的技術(shù)。隨著分離蛋白質(zhì)印跡聚合物的成功合成，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)已成為研究熱點。

高效毛細(xì)管電泳技術(shù)是20世紀(jì)80年代問世的一種高效液相分離技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，它已成為分析科學(xué)中最具活力的方法之一，因其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強和易自動化等特點，被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及高分子等多個領(lǐng)域。

作為蛋白質(zhì)產(chǎn)品分離純化的主流技術(shù)，柱層析具有很高的分離效率，通常采用固定床間歇操作方式，操作簡單，但存在著載體利用率低和過程效率低的問題。

采用連續(xù)逆流操作層析，分離效率和產(chǎn)率均有提高，對于難分離體系，逆流層析過程是一種有效分離手段。

7 結(jié)語

到目前為止，還沒有單一的方法能夠分離、純化出高純度的蛋白質(zhì)，應(yīng)依據(jù)物理、化學(xué)以及生物學(xué)特性的不同，采用多種分離方法，以便在分離、純化的同時，更好地保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)的分離、純化仍然是一項艱巨而繁重的任務(wù)。

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