范波勝， 婁季宇， 白宏英

腦梗死缺血壞死區(qū)血循環(huán)的改善和受損神經(jīng)組織的修復(fù)與功能重建，一直是腦梗死治療的兩個(gè)重點(diǎn)，只有這兩者的有效解決才有可能提高腦梗死的治療效果。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，能夠促進(jìn)和維持神經(jīng)細(xì)胞生長、存活，對(duì)腦缺血有重要的神經(jīng)保護(hù)作用［1］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是具有高度特異性的促血管內(nèi)皮生長的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)血管新生、改善缺血壞死區(qū)的血液循環(huán)，是治療腦梗死極有前途的細(xì)胞因子之一［2］。因此，將兩者聯(lián)合應(yīng)用于腦梗死的治療有望取得較好的治療效果。本研究擬采集和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，并將其作為靶細(xì)胞，借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將已構(gòu)建成功的重組pIRES-NGF-VEGF165雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大鼠BMSCs，以求獲得NGF和VEGF的有效表達(dá)，為下一步使用NGF和VEGF雙基因修飾的BMSCs移植治療腦梗死大鼠打下重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康1月齡SD大鼠，雌雄不限，體重約120g，用于骨髓搜集，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;PC12細(xì)胞為新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室王天云博士惠贈(zèng);種蛋由新鄉(xiāng)市平原雞場(chǎng)提供。pIRES質(zhì)粒購自 Clontech公司，重組 pIRES-NGFVEGF165質(zhì)粒由本研究室構(gòu)建。Percoll細(xì)胞分離液購自Sigma公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM-2000購自Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒、RT-PCR擴(kuò)增試劑盒購自 QIAGEN公司，兔抗大鼠 NGF、VEGF165多克隆抗體和SP9001試劑盒均購自Santa Cruz公司。

1.2 大鼠 BMSCs的采集與體外培養(yǎng)［3］將SD大鼠斷頭處死，無菌條件下取出股骨和脛骨，LDMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，緩慢加入等體積的Percoll細(xì)胞分離液，離心后小心吸取白膜細(xì)胞層，PBS洗滌后離心，去上清，加入L-DMEM培養(yǎng)基(含20%FBS，pH7.4)制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度大于5×106/ml，接種于 50ml培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3d換液一次，待細(xì)胞長至80% ～90%時(shí)，1∶2消化傳代，重復(fù)傳代，即可得到純化的BMSCs。

1.3 基因轉(zhuǎn)染 待培養(yǎng)至第3代的大鼠BMSCs細(xì)胞長至80% ～90%融合時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為3組。A組:正常培養(yǎng)的BMSCs;B組:pIRES空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BMSCs組;C組:重組 pIRES-NGFVEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs組。轉(zhuǎn)染過程按脂質(zhì)體LipofectamineTM-2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后在各組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)按400μg/ml加入G418進(jìn)行篩選，每3d換一次培養(yǎng)液，約1w左右A組細(xì)胞全部死亡，其余兩組出現(xiàn)抗性細(xì)胞克隆，挑選單克隆細(xì)胞，將G418濃度降至200μg/ml維持，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)后收獲細(xì)胞和上清液進(jìn)行下列檢測(cè)。

1.4 RT-PCR 檢測(cè) NGF、VEGFl65 mRNA 的表達(dá) 分別根據(jù)GENEBANK數(shù)據(jù)庫提供的NGF和VEGF165基因序列，設(shè)計(jì)NGF的擴(kuò)增引物為:P1:5’-GCC ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT C3’，P2:5’-GCC TCA GGC TCT TCT CAC AGC CTT C3’;VEGF165的擴(kuò)增引物為:P3:5’-GGC ATG AAC TTT CTG CTG TCT-3’，P4:5’-GCG TCA CCG CCT CGG CTT GTC-3’。分別提取3組細(xì)胞總的RNA，合成cDNA，建立各自的PCR反應(yīng)體系。NGF的PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3min，94℃變性40s，60℃退火30s，72℃ 延伸 40s，30個(gè)循環(huán)后于 72℃ 延伸3min;VEGF的PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃變性 60s，56℃退火 45s，72℃延伸 45s，30 個(gè)循環(huán)后于72℃延伸3min;反應(yīng)后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

1.5 Western blot法檢測(cè) NGF、VEGFl65 蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)72h的上清液，濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，按1∶200加入一抗(兔抗大鼠 NGF或 VEGF165多克隆抗體)，TBST洗滌后加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，TBST洗滌后在暗室中加ECL檢測(cè)試劑，X線曝光、顯影和定影保存。使用β-actin抗體作為上樣對(duì)照。

1.6 NGF、VEGFl65 蛋白的活性檢測(cè) (1)利用PC12細(xì)胞生長試驗(yàn)進(jìn)行NGF蛋白的活性檢測(cè)［4］:將PC12細(xì)胞用不含小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基接種于24孔板內(nèi)，收集各組用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72h的上清液滴加至各孔內(nèi)，0.5ml/孔。置于37℃、5%CO2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，觀察PC12細(xì)胞生長形態(tài)變化。(2)利用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管新生實(shí)驗(yàn)進(jìn)行VEGF的活性檢測(cè)［5］:將種蛋氣室向上放入溫箱(37.8℃)，第 8 天時(shí)借助照蛋器標(biāo)記胎位，在絨毛尿囊膜體表投影距胎頭1cm處將蛋殼鋸開一小三角形孔，虹膜刀切破殼膜，暴露出CAM，將濾紙片貼在CAM上，使用加樣器將各組培養(yǎng)72h的上清液100μl加入濾紙上，透明膠帶封閉窗口，每日加樣一次，第12天時(shí)觀察CAM新生血管情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及形態(tài)特征應(yīng)用密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中，其中以造血細(xì)胞占多數(shù)，通過數(shù)次換液后可清除這些細(xì)胞，可見少數(shù)細(xì)胞貼壁生長，呈圓形，逐漸分裂增殖，形成多個(gè)細(xì)胞團(tuán)。第5～10天細(xì)胞團(tuán)迅速生長，向周圍不斷擴(kuò)大，相互融合，第10～14天后達(dá)到80% ～90%融合;1∶2傳代的細(xì)胞在1d內(nèi)即可完全貼壁，不再以細(xì)胞團(tuán)方式生長，呈均勻分布生長的梭形細(xì)胞。

2.2 轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs及G418篩選 3組細(xì)胞加入400μg/ml G418后均出現(xiàn)絕大部分細(xì)胞死亡，從瓶底脫落，1w后正常對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡，其它兩組細(xì)胞僅存留幾個(gè)細(xì)胞貼壁存活，將G418濃度降至200μg/ml維持篩選，約10d后出現(xiàn)抗性細(xì)胞克隆，挑取單克隆，置24孔板內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

2.3 RT-PCR 檢測(cè) NGF、VEG165 mRNA 的表達(dá) 結(jié)果顯示:C組能夠擴(kuò)增出726bp和576bp兩條目標(biāo)條帶;而A組和B組未能擴(kuò)出目標(biāo)條帶。表明重組pIRES-NGF-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSCs內(nèi)有NGF和VEGF165 mRNA的表達(dá)。

2.4 Western blot法檢測(cè) NGF、VEGF165 蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示:C組在13.2KD和26KD出現(xiàn)兩條目標(biāo)條帶，提示有NGF和VEGF165重組蛋白的表達(dá);而A、B組則未見目的蛋白表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞NGF、VEGFl65蛋白的活性檢測(cè)

(1)PC12細(xì)胞生長試驗(yàn)結(jié)果顯示:C組細(xì)胞培養(yǎng)上清液能夠促進(jìn)PC12細(xì)胞發(fā)出如神經(jīng)細(xì)胞樣突起;而A、B組細(xì)胞培養(yǎng)上清液不能促進(jìn)PC12細(xì)胞發(fā)出突起，表明轉(zhuǎn)染NGF基因的BMSCs細(xì)胞分泌的NGF蛋白具有促進(jìn)PC12細(xì)胞生長的生物學(xué)活性。(2)CAM血管新生實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:C組細(xì)胞培養(yǎng)上清液較A、B組細(xì)胞培養(yǎng)上清液能夠明顯促進(jìn)CAM血管密度增加，血管增粗，分枝增多，表明轉(zhuǎn)染VEGF165基因的BMSCs表達(dá)的重組VEGF165蛋白具有促進(jìn)CAM血管生長的生物學(xué)活性。

3 討論

目前，腦梗死的“三高”(即高發(fā)病率、高致殘率、高致死率)嚴(yán)重威脅著人類健康，盡管近年來腦梗死的治療已取得了很大進(jìn)展，但治療效果仍不能令人滿意，人們一直在探索新的更有效的方法。隨著細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療已成為腦血管疾病防治的重要研究方向之一，尤其是將多種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因聯(lián)合應(yīng)用于腦梗死的基因治療更是成為最近研究中的熱點(diǎn)。

目的基因、基因載體以及靶細(xì)胞的選擇是進(jìn)行基因治療的重要基礎(chǔ)，直接關(guān)系到基因治療的成敗。本研究選擇NGF和VEGF165基因作為目的基因、真核雙基因表達(dá)質(zhì)粒pIRES作為基因載體和大鼠BMSCs作為靶細(xì)胞來進(jìn)行腦梗死的基因治療研究。首先，鑒于腦梗死治療的原則是既要盡快改善缺血壞死區(qū)血液循環(huán)又要促進(jìn)受損神經(jīng)組織的修復(fù)與功能重建，由于NGF對(duì)腦缺血有重要的神經(jīng)保護(hù)作用，VEGF則具有促進(jìn)血管新生、改善缺血壞死區(qū)的血液循環(huán)的作用，其中VEGF165是VEGF家族中發(fā)揮生物學(xué)功能的主要成分［2］，因此，我們選擇兩者作為目的基因。第二，選擇真核雙基因表達(dá)載體pIRES作為基因載體是由于該質(zhì)粒不但具有一般真核表達(dá)載體的特點(diǎn)，更為突出的特點(diǎn)是在兩個(gè)多克隆插入位點(diǎn)之間設(shè)計(jì)有微小RNA病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosomal entry site，IRES)。IRES可保證插入的兩個(gè)非相關(guān)基因能夠同時(shí)獨(dú)立高效地表達(dá)，所翻譯出的目的蛋白各自具有獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，這一功能已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)的證實(shí)［6，7］。第三，BMSCs是繼胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞之后，又一種在體內(nèi)外均能向神經(jīng)細(xì)胞分化的干細(xì)胞，它具有下列特點(diǎn)［8，9］:(1)易獲得性，骨髓穿刺就能得到該細(xì)胞，無倫理道德問題;(2)體外培養(yǎng)增殖速度快;(3)可通過血腦屏障到達(dá)腦內(nèi)各部位，并長期存活;(4)免疫耐受;(5)還有可以被凍存和培養(yǎng)等特點(diǎn)，并且相關(guān)實(shí)驗(yàn)［10］也證實(shí)附壁生長的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入外源性基因，并可以在體內(nèi)長期高效表達(dá)，因此BMSCs成為對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行基因治療的理想靶細(xì)胞。

在本研究中，我們借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將已構(gòu)建成功的重組pIRES-NGF-VEGF165雙基因真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入BMSCs，經(jīng)G418篩選，挑選陽性細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。分別從基因和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè)，即通過 RT-PCR方法檢測(cè)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 NGF、VEGF165基因mRNA的表達(dá)，使用Western blot方法檢測(cè)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)NGF、VEGF165蛋白。更進(jìn)一步進(jìn)行了兩者的活性檢測(cè):首先利用PC12細(xì)胞進(jìn)行NGF蛋白的活性檢測(cè)，PC12細(xì)胞來自于腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，在有NGF的情況下，PC12細(xì)胞可發(fā)出突起形成類似神經(jīng)細(xì)胞的表型［4］，我們通過收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)72h的上清液，滴加于PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中，結(jié)果見PC12細(xì)胞發(fā)出如神經(jīng)細(xì)胞樣突起，證實(shí)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的NGF蛋白具有生物學(xué)活性。接著利用CAM血管新生實(shí)驗(yàn)進(jìn)行VEGF165的活性檢測(cè):CAM是雞胚外的一層膜，在雞胚發(fā)育過程中有大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發(fā)生和形成提供了很好的模型，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在促進(jìn)血管生成和抗血管生成的研究之中［5］。我們通過收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)72h的上清液，滴加于CAM上，可見CAM血管增粗，分枝增多，證實(shí)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的VEGF165蛋白具有生物學(xué)活性。通過上述檢測(cè)證實(shí)，我們成功獲得了能夠有效表達(dá)NGF和VEGF165的大鼠BMSCs，為在下一步研究中將其移植治療腦梗死大鼠，發(fā)揮基因治療和干細(xì)胞治療-雙重治療效應(yīng)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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