黃周青，蔡雪黎，盧中秋，黃偉劍

（溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.心血管內(nèi)科；2.急診科）

研究證實，氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）是動脈粥樣硬化斑塊形成的主要危險因子[1]，其明顯增加單核源巨噬細胞CD36、LOX-1等的表達[2]。巨噬細胞通過清道夫受體如CD36、CD68、LOX-1或SRA等攝取oxLDL[3-6]，形成泡沫細胞。脂質(zhì)負荷的泡沫細胞死亡，形成壞死的富含膽固醇的脂質(zhì)核心，促進斑塊不穩(wěn)定，導(dǎo)致斑塊趨向破裂。斑塊破裂后，可釋放出斑塊脂質(zhì)核心處的壞死組織，引起血栓形成和隨后的動脈閉塞，從而引發(fā)急性冠脈事件的發(fā)生?？梢?，斑塊內(nèi)細胞泡沫化程度增加將大大不利于冠心病患者的轉(zhuǎn)歸。因此抑制巨噬細胞清道夫受體表達，減少oxLDL攝取，對動脈粥樣硬化防治具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)黃連素（berberine）通過上調(diào)低密度脂蛋白（LDL）受體抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集[7]，且增加LXR α-ABCA1通路促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的溢出[8]，提示黃連素在一定程度上可減少細胞泡沫化。但黃連素對巨噬細胞清道夫受體表達的影響尚不明了。因此，本研究從單核細胞向巨噬細胞分化過程及oxLDL刺激巨噬細胞模型分別揭示黃連素對清道夫受體表達的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素均購自GIBCO公司；佛波醇（PMA）為Calbiochem（San Diego，CA）產(chǎn)品；黃連素溶于二甲基亞砜（購自Sigma-Aldrich公司）；oxLDL購自北京協(xié)和醫(yī)科大學生化室；FITC-CD36（NL07）、PE-CD68抗體（Y1/82A）購自Ebioscience公司；FITC-LOX-1抗體（23C11）為Hycult biotechnology b.v.公司產(chǎn)品；流式細胞儀為BD FACSCalibur產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)和細胞處理 人單核細胞株（THP-1）來自于ATCC公司（USA）。以5×105/mL密度培養(yǎng)于RPMI 1640+10% FBS+1%青/鏈霉素培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以2×106/孔鋪于六孔板，10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)，加PMA（100 nmol/L）誘導(dǎo)48 h，促使其分化成巨噬細胞。然后換用低血清0.5% FBS RPMI 1640饑餓6 h，用黃連素（50μmol/L）預(yù)處理1 h后，加oxLDL（50μg/mL）刺激24 h，然后收集細胞檢測各組細胞清道夫受體表達。欲觀察單核細胞分化過程CD36的表達，實驗共分三組：單核細胞組、PMA組（加PMA誘導(dǎo)48 h）和PMA+Ber組（加PMA誘導(dǎo)前予50μmol/L黃連素預(yù)處理1 h）。欲觀察巨噬細胞受oxLDL刺激后的清道夫受體表達，實驗分三組：巨噬細胞組、oxLDL組（加oxLDL刺激24 h）和oxLDL+Ber組（加oxLDL刺激前予50μmol/L黃連素預(yù)處理1 h）。

1.3 流式細胞儀檢測 每次實驗收集1×104個細胞用于流式細胞分析，按操作說明用流式細胞儀測定各組細胞清道夫受體CD36、LOX-1、CD68的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 單核細胞向巨噬細胞分化過程中，黃連素對清道夫受體CD36表達的影響 如表1所示，與單核細胞比較，巨噬細胞表面CD36表達量明顯增加（增加約2倍），P＜0.01，而予黃連素干預(yù)后，CD36表達顯著降低（P＜0.01）。

2.2 巨噬細胞受oxLDL刺激后，黃連素對巨噬細胞表面清道夫受體CD36、LOX-1及CD68表達的影響如表2，oxLDL組巨噬細胞表面清道夫受體CD36、LOX-1和CD68表達明顯升高（P<0.01），黃連素處理可抑制巨噬細胞表面CD36、LOX-1的表達，但對CD68的表達無明顯影響（P>0.05)。

表1 單核細胞分化為巨噬細胞過程中，黃連素對CD36表達的影響（±s）

表1 單核細胞分化為巨噬細胞過程中，黃連素對CD36表達的影響（±s）

與單核細胞組比：aP＜0.01；與PMA組比：bP＜0.01

CD36平均熒光強度1.05±0.07 3.09±1.10a 2.24±0.14b組別單核細胞組PMA組PMA+Ber組

表2 各組巨噬細胞清道夫受體（CD36、LOX-1、CD68）平均熒光強度比較（±s）

表2 各組巨噬細胞清道夫受體（CD36、LOX-1、CD68）平均熒光強度比較（±s）

與巨噬細胞組比：aP＜0.01；與oxLDL組比：bP＜0.01

CD36 5.9±0.35 12.65±0.57a 9.85±0.78b組別巨噬細胞組oxLDL組oxLDL+Ber組LOX-1 10.75±0.76 14.74±0.88a 11.51±0.58b CD68 9.34±0.85 24.83±1.63a 25.4±1.35

3 討論

CD36是一種分子量為88 kD的膜糖蛋白，在單核/巨噬細胞、血小板、內(nèi)皮細胞表面均有表達，它以高親和力與oxLDL結(jié)合[9]，促進巨噬細胞吞噬oxLDL，誘導(dǎo)泡沫細胞形成；同時，被結(jié)合的oxLDL使細胞表面CD36表達上調(diào)，形成正向反饋。若CD36表達缺陷或受抑制，可減少巨噬細胞對oxLDL吞噬[10]。有研究[11]表明，他汀類（如atorvastatin）抑制單核源巨噬細胞清道夫受體CD36表達，減少細胞對oxLDL的攝取，提示抑制CD36表達可有效減少泡沫細胞形成。張社兵等[12]也報道，普羅布考抗動脈粥樣硬化機制之一就是抑制oxLDL誘導(dǎo)的CD36表達?？梢?，清道夫受體CD36在巨噬細胞內(nèi)促進脂質(zhì)聚集方面扮演重要角色，抑制CD36的表達將成為干預(yù)泡沫細胞形成的靶點之一。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，黃連素具有抗動脈粥樣硬化炎癥的作用，如減少基質(zhì)金屬蛋白酶及其誘導(dǎo)因子的表達、抑制細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、MAPK等信號通路的激活等[13]，然而，黃連素對巨噬細胞CD36表達的影響卻鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連素不僅能抑制單核細胞分化成巨噬細胞過程CD36的表達，同樣也抑制oxLDL刺激后巨噬細胞CD36的上調(diào)，提示黃連素減少巨噬細胞吞噬oxLDL，抑制泡沫細胞形成的分子機制至少一部分是通過抑制受體CD36表達實現(xiàn)的。

受體LOX-1在血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞中均有表達[14]。它結(jié)合吞噬oxLDL，促進單核源巨噬細胞、平滑肌細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化。LOX-1基礎(chǔ)表達很低，但是，一旦受致炎癥因子（如TNF-α、oxLDL等）刺激后細胞表面LOX-1表達迅速上調(diào)；且在高血壓、糖尿病或脂質(zhì)代謝異常等體內(nèi)環(huán)境下，LOX-1表達也明顯增加[2]。由于大多數(shù)高血壓、糖尿病、高脂血癥以及炎癥均直接或間接的與動脈粥樣硬化形成有關(guān)，所以他們的存在對LOX-1調(diào)節(jié)可起協(xié)同效應(yīng)?？梢?，LOX-1促進動脈粥樣硬化進展的重要作用不容忽視[2，15]。而CD68是巨噬細胞表面的另一受體，體外實驗已明確證實CD68能結(jié)合oxLDL[16]，因此我們在本研究中同時觀察了黃連素對oxLDL刺激的巨噬細胞LOX-1及CD68表達的影響，發(fā)現(xiàn)黃連素能降低巨噬細胞LOX-1的表達，但對CD68的表達無顯著影響。

綜上所述，黃連素減少巨噬細胞泡沫化的機制不僅與黃連素抑制CD36表達有關(guān)，也有賴于LOX-1表達的下調(diào)，但與CD68的表達無關(guān)。

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