林枝，車寶光，王學(xué)東，張洪勤，王慧利

（溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究方法進(jìn)展

林枝，車寶光，王學(xué)東，張洪勤，王慧利

（溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

生態(tài)毒理學(xué)；組學(xué)技術(shù)；生物標(biāo)志物；進(jìn)展；綜述文獻(xiàn)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化、集約化的不斷增加，污染物進(jìn)入到生態(tài)系統(tǒng)中的數(shù)量和種類日益增加。如農(nóng)藥、獸藥、飼料添加劑、抗生素等在環(huán)境中蓄積、遷移和降解而對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生廣泛而深遠(yuǎn)的影響?，F(xiàn)今新型污染物的種類不斷增加，如多環(huán)芳烴（PAH）、多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）、全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）、酚類環(huán)境雌激素（PEE）等，都具有殘留期長(zhǎng)、環(huán)境毒性大、不易降解等特點(diǎn)，致使在生態(tài)環(huán)境中長(zhǎng)期積累成為持久性有機(jī)污染物（POPs），對(duì)周邊生物包括人的健康造成嚴(yán)重威脅。面對(duì)復(fù)雜污染物的環(huán)境隱患，環(huán)境工作者準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的技術(shù)和方法也在不斷更新和完善。環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)是20世紀(jì)70年代初期發(fā)展起來(lái)的一個(gè)毒理學(xué)分支，是生態(tài)學(xué)與毒理學(xué)之間相互滲透的一門邊緣學(xué)科。它主要研究環(huán)境污染物以及各種不良生態(tài)因子的暴露對(duì)生命系統(tǒng)產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，以及生命系統(tǒng)反饋解毒與適應(yīng)進(jìn)化機(jī)制及調(diào)控作用，其特征是將宏觀生態(tài)理論與微觀機(jī)制結(jié)合起來(lái)，到目前為止，在這方面的研究已積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，取得了豐碩成果?，F(xiàn)就污染物毒理學(xué)研究方法的進(jìn)展作一綜述。

1 常規(guī)群體暴毒試驗(yàn)(群體水平上的研究)

環(huán)境污染物在生態(tài)系統(tǒng)中經(jīng)歷一系列復(fù)雜的理化和生物的變化，產(chǎn)生固有毒性、積累毒性、生物放大毒性和潛在毒性等，要正確評(píng)價(jià)其環(huán)境安全效應(yīng)，最基本的方法就是對(duì)生物群體進(jìn)行體內(nèi)或體外的暴毒實(shí)驗(yàn)，這種方法從宏觀角度、群體水平上，能更客觀直接地評(píng)價(jià)污染物的環(huán)境安全性和毒性效應(yīng)。比如吳聲敢等[1]選擇啶蟲(chóng)脒、丙溴磷、二嗪磷和馬拉硫磷4種殺蟲(chóng)劑對(duì)斜生柵列藻、大型溞和斑馬魚(yú)3種水生生物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。生物體在環(huán)境污染物的脅迫下，不管是藥物直接致毒還是代謝產(chǎn)物致毒，其毒理學(xué)終點(diǎn)都是對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的影響，及其致畸、致癌、致突變等現(xiàn)象的評(píng)判，量化的指標(biāo)為致死率、生長(zhǎng)抑制率及致畸率等。因此，常規(guī)群體暴毒試驗(yàn)是毒理學(xué)研究的第一步，韓建等[2]研究PFOS/PFOA急性毒性實(shí)驗(yàn)，表明PFOA是低毒性化合物，估計(jì)雄性和雌性大鼠的LD50分別為>500 mg/kg和250～500 mg/kg。

常規(guī)暴毒檢測(cè)方法（培養(yǎng)法、化學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)暴毒試驗(yàn)）具有實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、較易控制，數(shù)據(jù)可重復(fù)性高、比較可靠，直接反映污染效應(yīng)，耗費(fèi)較低，其結(jié)果具有直接的生態(tài)相關(guān)性等優(yōu)點(diǎn)，但其又具有滯后性、被動(dòng)性、間接性、實(shí)際推廣價(jià)值有限等缺點(diǎn)，單獨(dú)的常規(guī)暴毒的量化標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)不能滿足和適應(yīng)新形勢(shì)下人們對(duì)環(huán)境污染研究精確性的要求，尤其是急性暴毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能評(píng)判一些持久性環(huán)境污染物的慢性環(huán)境效應(yīng)。

2 生物標(biāo)志物的研究

污染物對(duì)生物體的毒性效應(yīng)必然是從作用于分子水平開(kāi)始的，然后逐步在細(xì)胞、器官、個(gè)體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各個(gè)水平上反映出來(lái)。在分子毒理學(xué)研究中，許多研究者首先從生物化學(xué)方面探索能反映污染物對(duì)生物早期的影響參數(shù)，其中，生物標(biāo)志物法因?yàn)闇y(cè)定指標(biāo)全面、準(zhǔn)確且系統(tǒng)，而得到了學(xué)者的公認(rèn)。

美國(guó)科學(xué)院生物標(biāo)志物委員會(huì)于1987年對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行系統(tǒng)論述，將生物標(biāo)志物定義為個(gè)體暴露于次生物質(zhì)后發(fā)生的亞致死性生物化學(xué)變化[3]，這種變化的檢測(cè)結(jié)果可作為生物體暴露效應(yīng)及易感性的指示物，可作為環(huán)境質(zhì)量退化的早期警報(bào)，而且可以特異性地檢測(cè)到環(huán)境中致癌、致畸、致突變化合物的生物可利用性。

2.1 行為標(biāo)志物（behavioral markers） 行為標(biāo)志物的檢測(cè)可反映發(fā)生在細(xì)胞或分子水平上所產(chǎn)生的綜合效應(yīng)。通常，隨著環(huán)境內(nèi)某一種影響因子濃度或影響力的升高，對(duì)個(gè)體的影響最先發(fā)生變化的是生物的行為。其運(yùn)動(dòng)行為的變化不僅能反映環(huán)境污染物質(zhì)對(duì)機(jī)體造成的代謝、神經(jīng)和肌肉等組織或器官功能的毒性[4]，而且能改變生物個(gè)體的捕食、躲避敵害等生存能力，從而對(duì)生物個(gè)體乃至整個(gè)生物群落的健康與環(huán)境適應(yīng)能力造成嚴(yán)重影響。

Johansson等[5]研究發(fā)現(xiàn)PFOS/PFOA具有神經(jīng)毒性效應(yīng)，表現(xiàn)為受試幼鼠的習(xí)慣性活動(dòng)減少等。金美青等[6]通過(guò)多物種凈水監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)在抗生素藥物和有機(jī)磷農(nóng)藥暴露下的行為強(qiáng)度變化，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)對(duì)環(huán)境變化的行為反應(yīng)快速且敏感，隨著藥物濃度的增加，斑馬魚(yú)行為強(qiáng)度的變化符合環(huán)境壓力模型。Viberg等[7]發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物圍生期暴露于PBDEs能導(dǎo)致幼體的行為異常，其中對(duì)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的損害尤為明顯；新生鼠單劑量經(jīng)口暴露于不同的PBDEs同系物下，10 d后大多數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)自主行為紊亂，記憶力下降。Lilienthal等[8]研究表明，胚胎發(fā)育期暴露于四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）、五溴聯(lián)苯醚（BDE-99）的小鼠出生后出現(xiàn)多動(dòng)癥；暴露于BDE-99還會(huì)引起性激素水平及對(duì)甜食偏好的改變。He等[9]發(fā)現(xiàn)十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）能導(dǎo)致斑馬魚(yú)仔魚(yú)的自由泳速度隨濃度升高而顯著下降。目前對(duì)PBDEs的研究多集中于神經(jīng)行為、認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)與記憶等神經(jīng)毒性效應(yīng)方面，而對(duì)PBDEs如何引起神經(jīng)毒性效應(yīng)的機(jī)制研究較少涉及。

行為標(biāo)志物檢測(cè)已采用計(jì)算機(jī)輔助生物測(cè)試系統(tǒng)，運(yùn)動(dòng)行為反應(yīng)較傳統(tǒng)的急性毒性指標(biāo)快速且敏感。因此，運(yùn)動(dòng)行為可以作為環(huán)境污染早期預(yù)警的生物在線監(jiān)測(cè)指標(biāo)。行為標(biāo)志物檢測(cè)的另一大優(yōu)點(diǎn)是對(duì)生物不產(chǎn)生損害。故污染物的行為學(xué)研究與生物信息學(xué)的有機(jī)結(jié)合得到發(fā)展。

2.2 生化標(biāo)志物（biochemical markers） 生化標(biāo)志物是生物體中最早可測(cè)得的污染物誘導(dǎo)反應(yīng)，可為更高生物水平可能產(chǎn)生的損害提供信息。生化變化常涉及蛋白水平的變化、酶活性改變或DNA分子的變化等。污染物進(jìn)入機(jī)體后，一方面在生物酶的催化作用下進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，另一方面也導(dǎo)致生物本身的酶活性改變。

在環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究中細(xì)胞色素P450酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）作為外源物質(zhì)的主要代謝酶被視為指示環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的重要生化標(biāo)志物。有研究結(jié)果表明，魚(yú)類、貝類的P450對(duì)環(huán)境誘導(dǎo)的反應(yīng)具有敏感性，并且有很好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。Ferrari等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鮭魚(yú)暴露于西維因后，GST活性受到抑制。Aijun等[11]采用實(shí)驗(yàn)室模擬條件，研究了不同劑量的BDE-209在不同時(shí)間段對(duì)鯽魚(yú)肝臟氧化脅迫指標(biāo)的影響，并對(duì)BDE-209致魚(yú)肝臟氧化損傷的毒性機(jī)制進(jìn)行了探討。

抗氧化防御系統(tǒng)是生物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)，過(guò)氧化氫酶（CAT）與超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）共同組成了生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)，因此，成分的改變也可作為機(jī)體遭受氧化脅迫的早期預(yù)警生物標(biāo)志物。例如，周科[12]用不同濃度BDE-47的污染沉積物暴露后，銅銹環(huán)棱螺肝胰臟的SOD和CAT活性表現(xiàn)出較為明顯的濃度或時(shí)間依賴性效應(yīng)關(guān)系。Jing等[13]將珍珠牡蠣暴露于含Pb的溶液中，經(jīng)不同時(shí)間段暴露之后分析其酶活性。結(jié)果表明經(jīng)Pb暴露之后牡蠣外套膜的SOD活性就被顯著地誘導(dǎo)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活性誘導(dǎo)率漸趨下降。

許多環(huán)境毒物如PAH、芳胺、亞硝胺、霉菌毒素和農(nóng)藥參與形成DNA加合物，對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致DNA分子的各種損傷，包括DNA鏈的斷裂、交聯(lián)、烷化DNA加合物、PAH-DNA加合物、環(huán)化加合物等的形成。彗星實(shí)驗(yàn)是近年發(fā)展起來(lái)的一種快速檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)方法。Geng等[14]用此方法通過(guò)敵敵畏、丁草胺對(duì)斑腿泛樹(shù)蠟蚌紅細(xì)胞DNA的損傷研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷程度隨著處理組濃度的增加而增加。Marczynski等[15]研究發(fā)現(xiàn)工作場(chǎng)所空氣中苯或萘濃度的增加可引起接觸工人的白細(xì)胞的DNA斷線率的增加。Bagchi等[16]證實(shí)萘可以誘使活性氧自由基增加,導(dǎo)致脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)和DNA的破壞。從文獻(xiàn)可以看出，PAH-DNA加合物是一種有效的生物標(biāo)志物，與環(huán)境暴露PAH有著密切的關(guān)系。

應(yīng)激蛋白又稱熱休克蛋白（HSP），包括HSP家族及分子伴侶，是細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的重要部分。近年來(lái)，很多研究用其作為環(huán)境效應(yīng)的生物標(biāo)志物。脊椎動(dòng)物金屬硫蛋白（MTs）的合成可被金屬、有機(jī)化合物或其他應(yīng)激因素誘導(dǎo)，其濃度不僅可反映急性毒性、污染物長(zhǎng)期作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程和累積情況，還可反映該動(dòng)物對(duì)污染物脅迫的解毒機(jī)制與解毒容量。跳蟲(chóng)分子生物標(biāo)志物引起人們的重視，尤其集中于對(duì)跳蟲(chóng)體內(nèi)金屬硫蛋白和應(yīng)激蛋白的研究。例如，有研究發(fā)現(xiàn)跳蟲(chóng)的應(yīng)激蛋白可被殺蟲(chóng)劑地樂(lè)酚顯著誘導(dǎo)[17]。

傳統(tǒng)毒理學(xué)的毒性測(cè)試研究使用的動(dòng)物多、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、工作量大，表型改變、形態(tài)學(xué)指標(biāo)等較為復(fù)雜，并不能揭示污染物對(duì)生物體的損害作用以及提供預(yù)警信息。所以需要一個(gè)綜合的、全面性和準(zhǔn)確性的環(huán)境監(jiān)測(cè)體系來(lái)高效、準(zhǔn)確地對(duì)污染物的生態(tài)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，而生物標(biāo)志物檢測(cè)特別是在分子水平上（DNA、RNA、離子通道和酶活性等）的變化，為揭示和預(yù)測(cè)污染物對(duì)個(gè)體的早期影響和對(duì)群體以至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的影響提供了重要信息。

3 免疫組織化學(xué)研究

免疫組織化學(xué)或稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，借助于光學(xué)、熒光或電子顯微鏡觀察其性質(zhì)定位，還可以利用細(xì)胞分光光度計(jì)、圖像分析儀、共聚焦顯微鏡等進(jìn)行細(xì)胞原位定量測(cè)定，來(lái)檢查細(xì)胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法。通過(guò)把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙結(jié)合起來(lái)，在微觀上原位地確定組織結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分乃至基因表達(dá)。由于其原位性、直觀性和特異性的優(yōu)點(diǎn)，被迅速擴(kuò)展應(yīng)用于污染物毒理學(xué)的研究上。朱愛(ài)華等[17]對(duì)洛克沙胂暴露下斑馬魚(yú)組織（鰓、肝臟、性腺）中HSP70的表達(dá)定位進(jìn)行了免疫組織化學(xué)初步研究，發(fā)現(xiàn)HSP70在斑馬魚(yú)的鰓、肝臟、性腺3種組織中有特異性表達(dá)。Han等[18]發(fā)現(xiàn)將斑馬魚(yú)暴露于硫丹下，在200 ng/L的處理組中雄性的肝臟指數(shù)（HSI）明顯上升，雌性的性腺指數(shù)（GSI）明顯下降；10 ng/L的處理組中雄性的HSI平均值最低，而其GSI卻最高。Zha等[19]用16 ng/L的17-β-乙炔基雌二醇（EE2）處理中國(guó)鰷魚(yú)，觀察到雌性中的GSI發(fā)生類似變化。黃莉等[20]運(yùn)用免疫組化的方法觀察小鼠妊娠子宮對(duì)四氯苯并-P-二惡英（TCDD）毒性的敏感性，發(fā)現(xiàn)低劑量TCDD暴露下出現(xiàn)的強(qiáng)烈生殖毒性與TCDD在小鼠子宮內(nèi)的蓄積和小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中細(xì)胞色素P4501A1的誘導(dǎo)能力有關(guān)。在運(yùn)用酵母基因系統(tǒng)進(jìn)行不同小鼠組織中TCDD含量檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，脂肪中TCDD蓄積量最多，其次是肝臟、子宮和胎兒。

免疫組織化學(xué)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，這是較之于其他化學(xué)方法不可替代的優(yōu)越性，又能夠有機(jī)地同形態(tài)、功能及代謝的研究結(jié)合起來(lái)，用以研究其他技術(shù)（如化學(xué)、生化、免疫和生理等）難以深入的領(lǐng)域。

4 組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

近年來(lái)興起的功能基因組學(xué)，為環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)的研究提供了良好的契機(jī)。組學(xué)研究不僅可能發(fā)現(xiàn)一些與該類藥物污染相關(guān)的差異表達(dá)的新基因、新蛋白，而且可對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行高度動(dòng)態(tài)的時(shí)空監(jiān)測(cè)。其中代謝組學(xué)方法則可為污染因子脅迫下生物體代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關(guān)性，能系統(tǒng)地掌握污染物的分子致毒機(jī)制。

4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics） 當(dāng)從mRNA水平考慮和對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究已無(wú)法滿足后基因組時(shí)代的要求時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。它以直接參與生命活動(dòng)的蛋白質(zhì)為研究目標(biāo)，界定表達(dá)蛋白質(zhì)過(guò)程中涉及的影響因素，已廣泛融入環(huán)境科學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)等領(lǐng)域。

毒理蛋白質(zhì)組學(xué)是在整體的蛋白質(zhì)水平上，探討生物接觸不同毒物或環(huán)境脅迫下，細(xì)胞蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式（蛋白質(zhì)譜）的變化，在更加貼近生命本質(zhì)的層次上探討和闡明有毒污染物及其濃度變化所致蛋白質(zhì)譜改變的“指紋特征”，也可作為有效表征污染物暴露的生物標(biāo)志物。

近幾年，從毒理蛋白質(zhì)組學(xué)角度分析污染物脅迫下生物基因表達(dá)與調(diào)控的變化成為研究熱點(diǎn)。Silvestre等[21]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了鎘對(duì)中華絨螯蟹的急慢性毒性，發(fā)現(xiàn)鎘急性中毒時(shí)，A-微管蛋白、GST以及甲殼類鈣結(jié)合蛋白等的表達(dá)下調(diào)，GST異形體表達(dá)上調(diào)。鎘慢性中毒時(shí)，GST及組織蛋白D等均過(guò)量表達(dá)，ATP合成酶B和A-微管蛋白等表達(dá)下調(diào)。Shrader等[22]研究了斑馬魚(yú)胚胎暴露于雌二醇、壬基酚及不同濃度的內(nèi)分泌干擾物時(shí)蛋白質(zhì)譜的變化，通過(guò)蛋白質(zhì)譜的差異表達(dá)說(shuō)明這兩種化合物的反應(yīng)路徑不同，致毒機(jī)制不同，作用的毒理學(xué)終點(diǎn)不同。徐立利等[23]結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法和軟件，構(gòu)建斑馬魚(yú)胚胎的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，分析表明在250 ppm濃度的毒死蜱脅迫下，24 hpf斑馬魚(yú)胚胎就產(chǎn)生19個(gè)差異蛋白質(zhì)。Villeneuve等[24]利用蛋白質(zhì)組學(xué)建立硬骨魚(yú)類下丘腦-垂體-性腺軸的毒理模型，包含魚(yú)類繁殖相關(guān)的6個(gè)主要器官，涉及調(diào)控軸上105個(gè)蛋白和40個(gè)小分子的相互作用，25個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

但是，總體而言毒理蛋白質(zhì)組學(xué)尚處于發(fā)展階段，研究范圍還非常有限，未來(lái)毒理蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展不僅需要高通量、高靈敏度、自動(dòng)化的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)作技術(shù)支撐，更需要通過(guò)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)方案、采用正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，使實(shí)驗(yàn)室內(nèi)與室外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，達(dá)到實(shí)驗(yàn)效益的最大化。

4.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics） 實(shí)際上，污染物的毒性效應(yīng)和生物應(yīng)答無(wú)疑是基因表達(dá)調(diào)控協(xié)同運(yùn)作的反應(yīng)信號(hào)，即使我們對(duì)每個(gè)生物標(biāo)志物的功能都已確定，有關(guān)致毒機(jī)制問(wèn)題也不能得到很好的解答。采用新一代高通量RNA-seq測(cè)序技術(shù)并借助于生物信息學(xué)分析軟件，對(duì)染毒和對(duì)照生物品系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控差異分析，尋找隱藏在基因組內(nèi)microRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)毒理學(xué)研究的關(guān)鍵，也是比較不同物種對(duì)環(huán)境污染敏感的多樣性、解毒代謝途徑多樣性的重要手段。Linney等[25]將斑馬魚(yú)胚胎暴露于毒死蜱，利用基因芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，45個(gè)基因明顯上調(diào)表達(dá)，15個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

最近才發(fā)展起來(lái)的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究成為人們深入毒理分子機(jī)制的最有效手段，也是生物領(lǐng)域嶄新的研究熱點(diǎn)。microRNA 是全基因組基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一部分，它隱藏于基因組內(nèi)的信息層，有學(xué)者稱之為基因組內(nèi)的“暗物質(zhì)”，不可見(jiàn)卻執(zhí)行著新層次調(diào)控基因表達(dá)的功能。目前只有很少部分microRNA功能通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定與環(huán)境脅迫應(yīng)答有關(guān)，這為以全microRNA表達(dá)圖譜來(lái)進(jìn)行毒理分析，即毒理microRNA基因組學(xué)提供了理論依據(jù)[26]。目前，利用microRNA毒理基因組學(xué)進(jìn)行毒理學(xué)分析的研究寥寥可數(shù)，而且大部分局限于單個(gè)microRNA的功能分析，還沒(méi)有人從全microRNA表達(dá)譜的角度來(lái)進(jìn)行研究。不過(guò)可以肯定的是，一些毒性相關(guān)的基因（如P450、p53等）的表達(dá)調(diào)控與microRNA相關(guān)[27]。

4.3 代謝組學(xué)（metabolomics） 轉(zhuǎn)錄組學(xué)可對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行高度動(dòng)態(tài)的時(shí)空監(jiān)測(cè)，而代謝組學(xué)方法則可為污染因子脅迫下生物體代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關(guān)性。通過(guò)代謝物化學(xué)分析技術(shù)及數(shù)據(jù)分析技術(shù)綜合運(yùn)用使得代謝組研究在疾病診斷、藥理研究以及毒理學(xué)等研究中發(fā)揮了極為重要的作用。

比較分析健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下小分子代謝物表達(dá)的差異，這有助于人們尋找各種疾病早期診斷的生物標(biāo)志物，可用于疾病預(yù)后及治療效果的評(píng)判。而在毒理學(xué)研究中，利用代謝組技術(shù)分析代謝物組分的變化可直接反映毒物脅迫對(duì)機(jī)體造成的最終影響。比如Lelliott等[28]利用磁共振與轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有機(jī)結(jié)合，研究表明三苯氧胺（TMX）作用通過(guò)降低脂肪酸合成酶（FAS）的表達(dá)及活性嚴(yán)重影響了肝臟內(nèi)脂肪代謝。梁宇杰[29]通過(guò)磁共振，統(tǒng)計(jì)大鼠尿液和血清的生化代謝產(chǎn)物譜，發(fā)現(xiàn)殘殺威、氯菊酷及等毒性混配劑的亞慢性染毒會(huì)引起一定程度的肝毒性和腎毒性。Williams等[30]利用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）研究D-絲氨酸給藥大鼠的尿液，發(fā)現(xiàn)色氨酸濃度升高而其代謝物含量下降，得出絲氨酸毒性損傷與抑制色氨酸分解代謝有關(guān)，同時(shí)給予一定劑量安息香酸鈉鹽能抑制D-絲氨酸引起尿液代謝功能的紊亂。

與其他毒理學(xué)研究方法一樣，代謝組學(xué)技術(shù)并不能解決所有問(wèn)題，但能為生物學(xué)多個(gè)領(lǐng)域的研究提供有用信息。比如，將蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，生物代謝的終點(diǎn)有助于驗(yàn)證基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究提出的假設(shè)。代謝組學(xué)研究使得代謝物含量變化與生物表型變化建立直接相關(guān)性，極大促進(jìn)了后基因組學(xué)時(shí)代功能基因組研究的發(fā)展。

5 展望

當(dāng)前，生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究正朝著多重性和實(shí)際性的方向發(fā)展。在現(xiàn)階段的研究中，還存在問(wèn)題如下：①毒理學(xué)研究的污染物設(shè)置濃度與環(huán)境中實(shí)際殘存濃度相差甚遠(yuǎn)，室內(nèi)高濃度的致毒效應(yīng)往往不能正確評(píng)估污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)際上，環(huán)境中尤其是城市污水處理廠處理末端的痕量污染物正是環(huán)境污染的主要源頭，經(jīng)過(guò)污水處理廠排水后造成二次污染。雖然這些痕量的漏檢物不會(huì)對(duì)生物帶來(lái)直接而快速的影響，但其長(zhǎng)期作用于生態(tài)系統(tǒng)可引發(fā)慢性致毒效應(yīng)，恰恰對(duì)水生生物和人類健康產(chǎn)生隱患，也是人們最易忽視的部分，因此應(yīng)加強(qiáng)污染物的慢性致毒機(jī)制研究，或?qū)ふ腋舾械臉?biāo)志物，作為野外真實(shí)環(huán)境的早期診斷及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的指標(biāo)。②多數(shù)情況下，單一化合物在環(huán)境中痕量存在使人們忽視其可能的環(huán)境效應(yīng)，然而，多種藥物在環(huán)境中同時(shí)存在則意味著加和或協(xié)同作用的可能性，但是在相對(duì)穩(wěn)定的生境下，多種藥物痕量水平的復(fù)合污染慢性毒理學(xué)效應(yīng)的研究報(bào)道還較少。實(shí)際上，生態(tài)系統(tǒng)中往往是結(jié)構(gòu)不同、作用模式不同的污染物以復(fù)合狀態(tài)共同存在，依靠單一的污染物研究不足以提供全面的風(fēng)險(xiǎn)信息，要準(zhǔn)確真實(shí)地評(píng)價(jià)其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，展開(kāi)不同作用模式的新型污染物痕量濃度的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究，建立生態(tài)毒理學(xué)模型體系成為當(dāng)務(wù)之急。③環(huán)境內(nèi)多重途徑的多種化合物的聯(lián)合作用是一個(gè)具挑戰(zhàn)性且有很強(qiáng)現(xiàn)實(shí)意義的課題。其聯(lián)合作用會(huì)隨混合物各組分組成、暴露時(shí)間、途徑、次序等不同而改變，在活體實(shí)驗(yàn)中，化合物在生物體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化更使研究復(fù)雜化。因此，有關(guān)環(huán)境污染物聯(lián)合暴露的研究一般集中在離體（in vitro）細(xì)胞試驗(yàn)上，而對(duì)于動(dòng)物的活體（in vivo）試驗(yàn)，鑒于實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果解析上的困難，研究較少。

利用微觀與宏觀方法相結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)有毒污染物的毒性將是重要的研究趨勢(shì)：分子、細(xì)胞、個(gè)體、種群、群落直至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)有機(jī)聯(lián)系的整體，在不同結(jié)構(gòu)和功能層次上闡述污染效應(yīng)對(duì)生態(tài)毒理學(xué)的環(huán)境解釋能力是不同的。從細(xì)胞到分子水平是毒理學(xué)微觀技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)，但僅從基因和蛋白質(zhì)水平上研究外源性化學(xué)物的毒性及其機(jī)制是不夠的。只有通過(guò)將細(xì)胞、分子水平的研究與整體、種群等各個(gè)不同層次的研究結(jié)合起來(lái)才能正確評(píng)價(jià)污染物的毒性效應(yīng)。

[1] 吳聲敢,陳麗萍,吳長(zhǎng)興,等. 4 種殺蟲(chóng)劑對(duì)水生生物的急性毒性與安全評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,23(1):101-106.

[2] 韓建,方展強(qiáng). 水環(huán)境PFOS和PFOA的污染現(xiàn)狀及毒理效應(yīng)研究進(jìn)展[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2010,3(2):99-105.

[3] Hyne RV, Maher WA. Invertebrate biomarkers:links to toxicosis that predict population decline[J]. Ecotox Environ Safe,2003,54(3):366-374.

[4] Sancho E, Fernandez-Vega C, Andreu-Moliner E, et al. Physiological effects of trieyelazole on zebrafish (Danio rerio)and post-exposure recovery[J]. Comp Biochem Phys C Toxicol Pharmacol,2009,150(1):25-32.

[5] Johansson N, Fredriksson A, Eriksson P. Neonatal exposure to perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoic acid (PFOA) causes neurobehavioural defects in adult mice[J]. Neurotoxicology,2008,29(1):160-169.

[6] 金美青. 典型手性農(nóng)藥擬除蟲(chóng)菊醋及其代謝產(chǎn)物對(duì)斑馬魚(yú)的發(fā)育毒性研究[D].浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文,2010.

[7] Viberg H, Johansson N, Fredriksson A, et al. Neonatal exposure to higher polybrominated diphenyl ethers, hepta-, octa-,or nonabromodiphenyl ether,impairs spontaneous behavior and learning and memory functions of adult mice[J]. Toxicol Sci,2006,92(1):211-218.

[8] Lilienthal H, Hack A, Roth-Harer A, et al. Effects of developmental exposures to 2,2’,4,4’,5-pentabromodiphenyl ether(PBDE99)on sex steroids,sexual development and sexually dimorphic behavior in rats[J]. Environ Health Persp,2006,114(2):194-201.

[9] He J, Yang D, Wang C, et al. Chronic zebrafish low does decabrominated diphenyl ether (BDE-209)exposure affected parental gonad development and locomotion in F1 off spring[J]. Ecotoxicology,2011,20(8):1813-1822.

[10]Ferrari A, Venturino A, Pechende D, et al. Effects of carbaryl and azinphos methyl on juvenile rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) detoxifying enzymes[J]. Pestic Biochem Phys,2007,88(2):134-142.

[11]Aijun Z, Huanqiang L, Aina Z, et al. Effect of BDE-209 on glutathione system inCarassius auratus[J]. Environ Toxic Phar,2011,32(1):35-39.

[12] 周科. 基于銅銹環(huán)棱螺的多溴聯(lián)苯醚BDE-47生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)[D].吉首大學(xué)生態(tài)學(xué)專業(yè)碩士學(xué)位論文,2011.

[13]Jing G, Li Y, Xie L, et al. Different effects of Pb2+and Cu2+on immune and antioxidant enzyme activities in the mantle ofPinetada fueata[J]. Environ Toxico Phar,2007,24(2):122-128.

[14]Geng BR, Yao D, Xue QQ. Genotoxieity of the pestieide dichlorvos and herbieide butachlor in Rhacophorus megacephalus tadpoles[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),2005,51(3):447-454.

[15]Marczynski B, Preuss R, Mensing T, et al. Genotoxic risk assessment in white blood cells of occupationally exposed workers before and after alteration of the polycyclic aromatic hydrocarbon(PAH)profile in the production material comparison with PAH air and urinary metabolite[J]. IntArch Occup Environ Health,2005,78(2):97-108.

[16]Bagchi M, Balmoori J, Ye X, et al. Protective effect of melatonin on naphthalene-induced oxidative stress and DNA damage in cultured macrophage cells[J]. Mol Cell Biochem,2001,221(1-2):49-55.

[17] 朱愛(ài)華,張雨梅,毛偉. 洛克沙胂暴露對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性及其組織中HSP70的表達(dá)定位[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(5):2351-2353.

[18]Han Z, Jiao S, Kong D, et al. Effects of β-endosulfan on the growth and reproduction of zebrafish(Dario reiro)[J].Environ Toxic Chem,2011,30(11):2525-2531.

[19]Zha J,Sun L,Zhou Y,et al. Assessment of 17a-ethinylestradiol effects and underlying mechanisms in a continuous multigeneration exposure of the Chinese rare minnow[J].Toxicol Appl Pharm,2008,226(3):298-308.

[20] 黃莉,呂嘉春. 妊娠小鼠子宮對(duì)2,3,7,8-四氯苯二英毒性的敏感性研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2005,25(3):334-339.

[21]Silvestre F,Dierick JF,Dumont V,et al. Differential protein expression profiles in anterior gills of Eriocheir sinensis during acclimation to cadmium[J]. Aquat Toxicol, 2006,76(1):46-58.

[22]Shrader EA, Henry TR, Greeley MS, et al. Proteomics in zebrafish exposed to endocrine disrupting chemicals[J].Ecotoxicology,2003,12(6):485-488.

[23] 徐立利. 毒死蜱脅迫下斑馬魚(yú)胚胎蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文,2010.

[24]Villeneuve D, Larkin P, Knoebl I, et al. A graphical systems model to facilitate hypothesis-driven ecotoxicogenomics research on the teleost brain-pituitary-gonadal axis[J].Environ Sci Technol,2007,41(1):321-330.

[25]Linney E, Upchurch L,Donerly S. Zebrafish as a neurotoxicological model[J]. Neurotoxicol Teratol, 2004,26(6):709-718.

[26]Klinge CM. Estrogen regulation of microRNA expression[J]. Curr Genomics,2009,10(3):169-183.

[27]Hudder A, Novak RF. miRNAs:Effectors of environmental influences on gene expression and disease[J]. Toxicol Sci,2008,103(2):228-240.

[28]Lelliott CJ, Lopez M, Curtis RK, et al. Transcript and metabolite analysis of the effects of tamoxifen in rat liver reveals inhibition of fatty acid synthesis in the presence of hepatic steatosis[J]. FASEB J,2005,19(9):1108-1119.

[29]梁宇杰. 基于NMR的代謝組學(xué)對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的生化效應(yīng)研究[D].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.

[30]Williams RE,Major H,Lock EA,et al. D-Serine- induced nephrotoxicity:a HPLC-TOF/MS-based metabonomics approach[J].Toxicology,2005,207(2):179-190.

Q3

C

1000-2138（2012）02-0192-05

2011-11-07

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（5100333）；浙江省科技廳公益項(xiàng)目（2011C23114）。

林枝（1990-），女，浙江臺(tái)州人，本科生。

王慧利，博士，副教授，Email：whuili@163.com。

吳健敏）

·高教研究·