車治萍，李秀秀，趙西博，曾常茜，張福胤，向 彬

(1.大連大學醫(yī)學院 檢驗系，遼寧 大連 116622；2.大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 口腔科，遼寧 大連 116011； 3.大連大學醫(yī)學院 口腔系，遼寧 大連 116622)

頭頸部惡性腫瘤患者術后放射治療常引起涎腺結(jié)構及功能的損傷，導致放射性涎腺炎的發(fā)生，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量，甚至阻礙放射治療的完成。苯腎上腺素為α1-腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor, α1-AR)激動劑，研究表明它可減輕大鼠腮腺放射性損傷[1]，該作用的機制尚不明確。主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)是一組廣泛參與機體抗原提呈及免疫排斥反應的高度多態(tài)性基因群，其中MHCⅠ類分子表達范圍最廣，可提呈內(nèi)源性抗原，啟動免疫應答，從而殺傷靶細胞。正常大鼠涎腺腺泡細胞和導管細胞均有MHCⅠ類分子的表達[2-3]，然而，放射損傷對頜下腺MHCⅠ類分子表達的影響以及苯腎上腺素對放射損傷早期頜下腺MHCⅠ類分子表達的作用，國內(nèi)外均未見文獻報道。本實驗從蛋白質(zhì)及基因水平研究放射性損傷早期大鼠頜下腺MHCⅠ類分子分布與表達的變化，為深入探討α1-AR受體后信號分子通路在放射性涎腺損傷中的免疫分子機制奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康成年Wistar大鼠27只，體重230～250 g，雌雄不限，購自大連醫(yī)科大學SPF動物實驗中心。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠抗人HLA I單克隆抗體購自美國Sigma公司；生物素標記IgG、辣根酶標記鏈酶卵白素及濃縮型DAB(3, 3′-diaminobenzidine, DAB)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit購自美國Fermentas公司，2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化科技有限公司。直線加速器(Varian 23EX，美國)，正置熒光落射顯微鏡(Nikon，日本)，熒光凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)，PCR儀(Thermo，美國)。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗動物分組及處理：將27只Wistar大鼠隨機分為3組(每組各9只)：空白對照組、單純照射組及照射給藥組(腹腔注射苯腎上腺素5 mg/kg，2次/d，連續(xù)給藥7 d；空白對照組和單純照射組經(jīng)腹腔注射等液量生理鹽水)。氯胺酮(130 mg/kg)腹腔注射麻醉后，應用直線加速器給予單純照射組及照射給藥組大鼠頜下腺區(qū)域X線照射：照射野為3 cm×31 cm，照射靶皮距為100 cm，照射劑量率為5 Gy/min，總劑量為20 Gy。空白對照組僅腹腔注射氯胺酮，未實施照射。照射后7 d，常規(guī)麻醉下取大鼠頜下腺組織，分兩部分：一部分多聚甲醛固定，石蠟包埋；另一部分液氮冷凍，-80℃保存。進行下列檢測。

1.3.2 免疫組織化學(ABC法)染色檢測各組大鼠頜下腺MHCⅠ類分子的表達：石蠟切片脫蠟水化；PBS洗3次，各5 min；3%H2O2甲醇溶液室溫孵育20 min；PBS洗3次，各5 min；微波中火在枸櫞酸鹽溶液中煮沸10 min抗原修復；PBS洗3次，各5 min；馬血清室溫封閉30 min；滴加一抗MHCⅠ類分子(1∶200)，37℃孵育1 h后4℃過夜；PBS洗3次，各5 min；生物素標記的二抗室溫孵育1 h；PBS洗3次，各5 min；辣根酶標記的鏈酶卵白素室溫下孵育30 min；PBS洗3次，各5 min；DAB顯色，蘇木素復染，封片。陰性對照使用PBS代替一抗。顯微鏡下觀察陽性細胞表達情況。

1.3.3 RT-PCR檢測各組大鼠頜下腺MHCⅠmRNA的表達：取各組大鼠頜下腺組織約100 mg，Trizol法提取總RNA。取5 μg RNA進行RT-PCR。引物根據(jù)文獻[2]報道并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。PCR擴增循環(huán)：94℃ 30 s，54℃ 60 s和72℃ 60 s；35個循環(huán)后72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，DNA green結(jié)合后于紫外燈下觀察。UVP BioChemi System熒光凝膠成像系統(tǒng)拍照，Quantity One 4.6.2軟件對PCR產(chǎn)物進行光密度掃描和分析。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物大小Tab 1 Primers’ sequence and production size used for RT-PCR

1.5 統(tǒng)計學方法

定量數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進行分析，兩組間差異顯著性比較采用t檢驗，多組資料分析采用單因素方差檢驗(One-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學染色結(jié)果

大鼠頜下腺腺泡及導管細胞的胞漿和胞膜中棕黃色顆粒為MHCⅠ類分子陽性染色(圖1D)。單純照射組大鼠頜下腺腺泡及導管細胞的胞漿和胞膜中MHC Ⅰ類分子染色較空白對照組明顯增加，以胞膜和細胞間質(zhì)的表達增多尤為顯著(圖1E)。照射給藥組MHCⅠ類分子在腺泡細胞胞膜以及細胞間質(zhì)中的表達較單純照射組顯著減少(圖1F)。

圖1 苯腎上腺素對放射損傷后大鼠頜下腺MHCⅠ類分子定位與表達的影響Fig 1 Effect of phenylephrine on the distribution and expression of MHC class Ⅰ in rat submandibular glands after irradiationA：腺泡細胞；D：導管細胞 A，D：空白對照組；B，E：單純照射組；C，F(xiàn) ：照射給藥組。A 、B和C： HE染色 ×200； D、E和F：DAB染色 ×200

2.2 RT-PCR結(jié)果

單純照射組MHCⅠ類分子 mRNA的表達較空白對照組增加了45.85%(P<0.05)；照射給藥組MHCⅠ類分子 mRNA的表達較單純照射組減少了33.88%(P<0.05)(圖2)。

3 討 論

涎腺由于其解剖位置的特殊性及對放射線的敏感性，在頭頸部惡性腫瘤術后放療過程中常不可避免地受到損傷，導致放射性涎腺炎的發(fā)生。組織病理學主要表現(xiàn)為腺泡細胞變性萎縮、細胞水腫和空泡化，導管擴張，間質(zhì)纖維化和血管內(nèi)皮細胞改變，單核細胞及淋巴細胞浸潤等[4-8]。研究發(fā)現(xiàn)，應用苯腎上腺素可顯著減輕X線照射后早期和晚期大鼠腮腺損傷，并可維持腮腺的體積、重量和分泌功能與未照射的腺體相似[1]。然而，苯腎上腺素發(fā)揮保護涎腺抵御放射損傷的免疫機制國內(nèi)外尚無文獻報道。

圖2苯腎上腺素對放射損傷后大鼠頜下腺MHCⅠmRNA表達的影響

Fig 2 Effect of phenylephrine on the expression of MHCⅠmRNA in rat submandibular glands after irradiation

Control：空白對照組；IR：單純照射組；IR+PE：照射給藥組

*與空白對照組比較，P<0.05；#與單純照射組比較，P<0.05。

苯腎上腺素在臨床主要用于升高血壓、減慢心率、抗休克及陣發(fā)性室上性心動過速的治療。然而，其在涎腺中卻起不同的作用。在涎腺的生理狀態(tài)下，α1-AR通路活化，能夠介導涎液中水分的主動運輸[9]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，苯腎上腺素對應激狀態(tài)下涎腺具有兩方面作用：涎液分泌促進作用及細胞保護作用[10]。在自體血管化移植家兔頜下腺，苯腎上腺素可上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)Bax的表達，抑制caspase-3和p38 MAPK的活化，進而抑制細胞凋亡，減輕移植頜下腺細胞缺血再灌注損傷，保護移植家兔頜下腺[11]。最近的研究還表明，苯腎上腺素激活α1-AR信號通路參與了炎癥的自主免疫調(diào)節(jié)，例如在脂多糖誘導的單核細胞炎癥反應中，IL-1β表達降低，而苯腎上腺素可以使IL-1β表達增加，該作用可以被PKC抑制劑所阻斷[12]。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)苯腎上腺素可以減輕放射損傷導致的大鼠頜下腺細胞萎縮，本實驗進一步探討此作用是否與α1-AR信號通路激活的免疫調(diào)節(jié)機制相關。

組成MHC的基因傳統(tǒng)上分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類分子，近年來傾向于分為兩類：一是經(jīng)典的MHCⅠ類和Ⅱ類基因，它們的產(chǎn)物具有抗原提呈功能，直接參與T細胞的激活和分化，調(diào)控特異性免疫應答；二是免疫功能相關基因，包括傳統(tǒng)的Ⅱ類基因，以及除經(jīng)典的Ⅰ類和Ⅱ類基因之外的新近確認的多種基因，它們主要參與調(diào)控固有免疫應答[13]。MHC Ⅰ類分子表達分布于大部分組織細胞表面，為α鏈與β2微球蛋白組成的異二聚體，8條反向平行的β折疊鏈及2條平行的α螺旋共同構成的抗原結(jié)合槽，其內(nèi)可結(jié)合8～11個氨基酸殘基的多肽，其化學成分是糖蛋白或脂蛋白，可通過與細胞間共刺激分子的協(xié)同作用，促進T淋巴細胞對內(nèi)源性抗原的識別，從而殺傷靶細胞。

本實驗發(fā)現(xiàn)，20 Gy X射線照射大鼠頜下腺后，MHC Ⅰ類分子蛋白質(zhì)在腺泡細胞及導管細胞的胞漿和胞膜表達均增加，尤其以胞膜基底部和細胞間質(zhì)的表達增加更為顯著，提示MHC Ⅰ類分子可能在頜下腺受到放射損傷后發(fā)揮了抗原提呈的作用；RT-PCR結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平進一步證明了放射線損傷導致大鼠頜下腺MHC Ⅰ mRNA表達豐度明顯增加。從而，從基因和蛋白質(zhì)水平共同首次證明了放射線對頜下腺的損傷機制與免疫應答相關。本研究結(jié)果與Reits等[14]應用γ射線照射小鼠黑素瘤細胞及HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠腎細胞后發(fā)現(xiàn)MHC Ⅰ類分子表達均增加的結(jié)論相一致。放射線對頜下腺照射損傷后，連續(xù)給予苯腎上腺素7 d，MHC Ⅰ類基因和蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均發(fā)生了降低，提示苯腎上腺素減輕頜下腺細胞的放射線損傷的機制可能與α1-AR信號分子通路活化后介導的相關免疫調(diào)節(jié)機制相關。在本實驗中，大鼠頜下腺經(jīng)放射線照射后，MHC Ⅰ類分子的表達上調(diào)，可能增強了腺泡細胞和導管細胞向TC細胞提呈抗原的作用，從而促進TC細胞殺傷靶細胞的能力；而苯腎上腺素可能是通過下調(diào)MHC Ⅰ類分子的表達，減弱TC細胞對自身頜下腺細胞的識別及殺傷作用，從而起到對放射損傷早期頜下腺細胞的保護作用。然而，由于機體抗原提呈作用的發(fā)揮還需要其他輔助分子如Calnexin、ERp57、Calreticulin和Tapasin等的共同參與，因此，α1-AR活化在涎腺放射損傷中介導的相關免疫分子機制還需進一步研究。本研究將為從免疫分子水平尋找防治涎腺細胞放射損傷的新方法奠定實驗基礎。

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