張慶慶，呂聞聞，湯文晶，許鵬

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院/微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖，241000)

γ-氨基丁酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于整個神經(jīng)系統(tǒng)中［1］。研究表明GABA具有治療精神分裂癥、帕金森病、高血壓、腎機(jī)能和肝機(jī)能改善作用、增加生長激素分泌、健肝利腎和消臭等等［2－3］。

豆渣中含有膳食纖維、蛋白質(zhì)及鈣、磷、鐵、維生素等微量的營養(yǎng)成分，具有很高的使用價值［4］。我國目前對豆渣的研究主要集中在一般性應(yīng)用(如直接將豆渣用作油炸食品、烘烤食品等的輔料)和豆渣膳食纖維的研究等方面［5］，未能有效解決豆渣的綜合利用問題，相當(dāng)一部分豆渣由于含水量過大、處理不及時極易酸敗發(fā)臭，不僅浪費(fèi)大量的可利用資源，同時造成環(huán)境污染［6－7］。在紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究過程中，目前大多采用大米作為原料［8－9］，而以豆渣為基質(zhì)進(jìn)行產(chǎn) γ-氨基丁酸的研究較少。豆渣作為一種價格低廉的原料可以替代大米粉等用來發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸，不僅價格低廉，來源充足，同時能夠解決廢棄豆渣所造成的環(huán)境污染，為豆渣變廢為寶開辟新的途徑。

本文以紅曲霉ZL307為發(fā)酵菌種，豆渣為主要原料，對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌種

紅曲霉ZL307(Monascus ZL307)，由微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯20.00 g，葡萄糖2.00 g，瓊脂2.00 g，自來水100 mL，pH自然。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖6.00 g，蛋白胨 0.50 g，Mg-SO40.10 g，KH2PO40.25g，自來水 100 mL，pH 自然。

初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:20 g/250 mL錐形瓶，干豆渣12.00 g、大米粉 8.00 g，(NH4)2SO40.20%，Mg-SO40.25%，KH2PO40.25%，CaCl20.25%，谷氨酸鈉0.30%(均為占固體基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù))，初始含水量50%(V/W)，初始pH值 6.0。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):將保藏紅曲霉菌種接入斜面培養(yǎng)基中恒溫32℃，培養(yǎng)7 d。再將斜面菌種接入含100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，32℃，150 r/min恒溫培養(yǎng)48 h。

固態(tài)培養(yǎng):將紅曲霉種子液接入固態(tài)培養(yǎng)基中，接種量20%(占基質(zhì)干重)，溫度32℃，恒溫培養(yǎng)12 d。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品處理

固態(tài)發(fā)酵后的紅曲制品烘干粉碎后加入10倍體積的蒸餾水，溫度55℃，浸提3 h，4層紗布過濾濾液離心(4 000 r/min)5 min。取上清液，0.45 μm 微濾膜過濾，經(jīng)衍生化處理后進(jìn)樣。

1.4.2 γ-氨基丁酸含量測定［10］

采用膠束毛細(xì)管電泳法(MEKC)，熔融石英毛細(xì)管柱50 μm×60 cm(有效長度50 cm)，異硫氰酸苯脂(PITC)為柱前衍生化試劑，100 mmol/L硼砂(pH 9.5)為運(yùn)行緩沖液，分離電壓25 kV，柱溫20℃，檢測波長250 nm。

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 單因素實驗

主要考察固體基質(zhì)、含水量、pH值、溫度對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響。

1.5.2 Plackett-Burman實驗

通過單因素試驗和相關(guān)文獻(xiàn)報道，影響γ-氨基丁酸產(chǎn)量的因素有大米粉、(NH4)2SO4、MgSO4、KH2PO4、CaCl2、谷氨酸鈉。選用 N=12的 Plackett-Burman設(shè)計，每個因素分別取低和高2個水平，高水平是低水平的1.5倍，響應(yīng)值為 γ-氨基丁酸產(chǎn)量(Y)，因子編碼水平表見表1，用SAS 9.2對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因子編碼水平表

1.5.3 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析。并以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定下一步試驗的最陡爬坡路徑(包括變化方向和變化步長)，快速的逼近最佳區(qū)域。

1.5.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Plaekett-Burman試驗確定出了影響γ-氨基丁酸產(chǎn)量的主要因素，根據(jù)最陡爬坡實驗確定接近響應(yīng)值區(qū)域顯著因素的濃度，接下來利用3因素3水平的Box-Behnken實驗進(jìn)行優(yōu)化，以γ-氨基丁酸含量(mg/g)Y為響應(yīng)值，用SAS軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 基質(zhì)對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

表2為不同基質(zhì)配比產(chǎn)γ-氨基丁酸結(jié)果，由表2可知，單純使用豆渣，容易結(jié)塊，γ-氨基丁酸含量較低，豆渣和米粉的質(zhì)量比由9∶1變?yōu)?∶4過程中，米粉的增加可以迅速增加γ-氨基丁酸的含量，當(dāng)配比為6∶4時，即占固體基質(zhì)的40%時，γ-氨基丁酸產(chǎn)量達(dá)到最大，繼續(xù)增加米粉含量，γ-氨基丁酸產(chǎn)量開始降低?？梢娺^高的米粉含量不僅會造成原料的浪費(fèi)，而且還會使產(chǎn)量下降。

表2 固體發(fā)酵基質(zhì)對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

2.1.2 基質(zhì)初始含水量對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

本實驗研究了不同含水量對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響，如表3所示，當(dāng)含水量達(dá)到60%時，產(chǎn)量達(dá)到最大。通過統(tǒng)計學(xué)分析，含水量在40%～50%的變化過程影響極顯著，在50% ～60%的變化過程中影響不顯著。在60%～80%范圍內(nèi)產(chǎn)量逐漸下降。原因可能是水分過低，基質(zhì)較干燥，菌體生長受到抑制，水分過多，基質(zhì)出現(xiàn)結(jié)團(tuán)，不利于菌體的呼吸，影響到氧的傳遞和發(fā)酵熱的散失，極易發(fā)酸、發(fā)臭。

表3 基質(zhì)含水量γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

2.1.3 pH值對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

不同pH值對γ-氨基丁酸的影響如表4所示，pH值在4.5～5.5，γ-氨基丁酸產(chǎn)量緩慢增加，pH5.5時，產(chǎn)量最高，pH超過6之后產(chǎn)量開始下降。通過統(tǒng)計學(xué)分析，pH在4.5～5.5的變化過程影響不顯著，pH 6～6.5的變化影響顯著。原因可能是初始pH值過低時，抑制了菌體的生長代謝，從而對底物的利用率降低，γ-氨基丁酸產(chǎn)量明顯減少。當(dāng)初始pH值較高時，細(xì)菌生長良好，但代謝生產(chǎn)γ-氨基丁酸途徑中關(guān)鍵酶活力不足，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。

表4 pH值對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

2.1.4 溫度對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

本實驗考察了不同溫度對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸的影響，如表5所示，通過統(tǒng)計學(xué)分析γ-氨基丁酸產(chǎn)量影響，溫度在24～32℃的變化過程影響極顯著，36～40℃的變化過程影響也極顯著。32℃時達(dá)到最大，之后開始下降。原因可能是溫度過低，菌體生長緩慢，延滯期較長，生長周期延長。溫度過高，菌體細(xì)胞的活力受到抑制，引起菌體的死亡，菌體生長受到抑制影響。

表5 溫度對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

2.2 Plackett-Burman實驗

由單因子實驗可知，對紅曲霉產(chǎn)γ-氨基丁酸有影響的因素有大米粉(X1)、(NH4)2SO4(X3)、MgSO4(X4)、KH2PO4(X5)、CaCl2(X6)、谷氨酸鈉(X8)，分別作為PB實驗的6個因素，加上3個因素用于估計誤差(X2、X7、X9)，Plackett-Burman 設(shè)計試驗方案及結(jié)果見表6，用SAS 9.2對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并對回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗，見表6。

表6 Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果

表7 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

由表7可知，大米粉和MgSO4的P值均小于0.01，表明高度顯著。KH2PO4的P＜0.05，表明顯著，確定這3個因素為影響γ-氨基丁酸的顯著因素。由t值檢驗可知，大米粉含量，MgSO4含量為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)的實驗中應(yīng)該降低大米粉和MgSO4含量。KH2PO4含量為正效應(yīng)，在后續(xù)的實驗中應(yīng)該增加其含量。非顯著性因子中，(NH4)2SO4、CaCl2為負(fù)效應(yīng)，在后續(xù)的試驗中應(yīng)該取低水平，而谷氨酸鈉為正效應(yīng)，在后續(xù)的試驗中應(yīng)該取高水平。

2.3 最陡爬坡實驗

在確定發(fā)酵培養(yǎng)基(NH4)2SO40.2%，CaCl20.25%，谷氨酸鈉0.45%后，選定大米粉、MgSO4和KH2PO4三個關(guān)鍵因素進(jìn)行最陡爬坡實驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表8。由表8可知，γ-氨基丁酸的產(chǎn)量隨著關(guān)鍵因素的變化而變化，產(chǎn)量最高值出現(xiàn)在第2組，達(dá)到0.416 mg/g，說明此時大米粉、MgSO4、KH2PO4的濃度接近最優(yōu)，故選擇第2組作為中心點(diǎn)，進(jìn)一步對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

表8 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

2.4 Box-Behnke試驗設(shè)計篩選重要因素的最優(yōu)水平

由最陡爬坡實驗可知，以表8中實驗2的條件為中心點(diǎn)，利用SAS軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面實驗。因素及水平表見表9，實驗設(shè)計及結(jié)果見表10。

表9 響應(yīng)面分析實驗因素水平表

表10 實驗設(shè)計及結(jié)果

以γ-氨基丁酸含量為響應(yīng)值，運(yùn)用SAS軟件對表10中的實驗結(jié)果結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到方程為Y=0.413 667+0.011 25X1+0.003 25X2－0.004 75X3－0.020 833－0.007X1X2+0.004X1X3－0.015 333+0.001 5X2X3－0.028 333?；貧w方程的方差分析及模擬可信度分析結(jié)果見表11。

由表11方差分析可以看出，該模型極顯著［(Pr＞F)=0.003］，在模型各參數(shù)中，X1對γ-氨基丁酸產(chǎn)量有較顯著的影響，即大米粉是對實驗結(jié)果影響較大的因子，，對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響也達(dá)極顯著水平，說明MgSO4、KH2PO4對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響是二次關(guān)系。該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.968 7，修正決定系數(shù)=0.912 4，表明該模型預(yù)測值和實測值擬合良好，可以很好地解釋響應(yīng)值的變化。變化系數(shù)CV=1.684 856，表示實驗數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信。

表11 回歸方程的方差分析

2.5 響應(yīng)面分析及培養(yǎng)成分確定

用SAS軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面立體分析圖，見圖1～圖3。由圖及軟件分析可知，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，通過嶺峪分析知X1，X2，X3的編碼值分別為 0.256 36，0.044 304，－0.064 55，即大米粉總基質(zhì)的含量為38.6%，MgSO4為0.23%，KH2PO4為0.37%，此條件下預(yù)測得到的γ-氨基丁酸的產(chǎn)量為0.419 mg/g。

2.6 驗證實驗

為檢驗響應(yīng)面法回歸方程預(yù)測是否可靠，采用上述最佳條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。總基質(zhì)為20g，大米粉占總基質(zhì)的含量為38.6%，即大米粉為7.72 g，豆渣為12.28 g。MgSO4為0.23%，KH2PO4為0.37%，所得γ-氨基丁酸的產(chǎn)量為0.417 mg/g，與方程預(yù)測值相比，相對誤差在1%以內(nèi)。這表明響應(yīng)面法擬合的回歸方程可以用于預(yù)測實際的γ-氨基丁酸產(chǎn)量。

圖1 Y=f(X1，X2)響應(yīng)面立體分析圖

3 結(jié)論

圖3 Y=f(X1，X3)響應(yīng)面立體圖

本文分別研究了基質(zhì)配比、pH值、初始含水量、溫度對發(fā)酵的影響，并采用響應(yīng)面實驗設(shè)計方法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過Plaekett-Burman設(shè)計從影響紅曲霉產(chǎn)γ-氨基丁酸培養(yǎng)基中篩選出了大米粉、Mg-SO4、KH2PO4三個重要因素，Box-Behnke試驗設(shè)計實現(xiàn)了條件的優(yōu)化。最終得到紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸的最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為:基質(zhì)豆渣12.28g，大米粉為 7.72g，(NH4)2SO40.2%，MgSO40.23%，KH2PO40.37%，CaCl20.25%，谷氨酸鈉0.45%(均占固體基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù))，初始含水量60%，初始pH值5.5，溫度32℃。在優(yōu)化條件下，γ-氨基丁酸產(chǎn)量達(dá)到0.417 mg/g，比優(yōu)化前提高了13.4%。

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