徐婷婷，高明，呂淑霞*，于曉丹，張忠澤，陳宏權(quán)

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866;2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽110016;3.東北制藥總廠Vc公司，遼寧沈陽110028)

維生素C又稱L-抗壞血酸(L-Ascorbic Acid)，作為人體必需的維生素及抗氧化類物質(zhì)，受到人們普遍關(guān)注，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)等多個領(lǐng)域，需求量與日俱增［1］。上世紀(jì)70年代我國學(xué)者尹光琳發(fā)明了“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)Vc［2］，該方法工藝簡單、成本低、“三廢”少，已成為我國Vc工業(yè)生產(chǎn)的主要方法［3］。其中第2步將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為Vc前體2-酮基-L-古龍酸，由產(chǎn)酸菌—氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和伴生菌—巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)共同完成。產(chǎn)酸菌單獨生長和傳代困難，對伴生菌依賴性較強。目前已知具有伴生能力的菌屬有芽胞桿菌、假單胞菌、歐文氏菌、微球菌、熒光桿菌、變形菌、腸桿菌和酵母菌［4］等，但由于伴生能力較差，促產(chǎn)酸不穩(wěn)定，菌株易污染等多方面因素，生產(chǎn)中常用的依然是巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)，菌種較單一。本文以短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)HJ-04作為伴生菌與產(chǎn)酸菌搭配，發(fā)現(xiàn)其能更好地促進產(chǎn)酸菌生長及產(chǎn)酸，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化［5］后新菌系的產(chǎn)酸量進一步提高，產(chǎn)酸周期縮短，具有良好的科研價值及應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)B2980和氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)，由東北制藥總廠提供。短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)HJ-04由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生化實驗室提供。1.1.2培養(yǎng)基(g/L)①種子培養(yǎng)基:山梨糖20，葡萄糖2，尿素1，玉米漿5，CaCO31，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃滅菌30 min;②發(fā)酵培養(yǎng)基:優(yōu)化前:山梨糖80(單獨滅菌)，尿素12，玉米漿10，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃滅菌30 min。優(yōu)化后:山梨糖94.95(單獨滅菌)，尿素11.99，玉米漿14.13，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)①混合菌種子培養(yǎng):150 mL三角瓶裝液量20 mL，向混合菌斜面中加入少量無菌水，刮下菌苔并混勻。吸取1 mL菌液接種到種子培養(yǎng)基中，29℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h;②混合菌發(fā)酵培養(yǎng):150 mL三角瓶裝液量10 mL，吸取1 mL產(chǎn)酸菌種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，29℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 2-KGA含量的測定取2 mL發(fā)酵液于試管中，加入2 mL 7 mol/L H2SO4，100℃煮沸30 min。冷卻后以1%淀粉作指示劑，用0.05 mol/L I2溶液滴定至藍色為反應(yīng)終點。按以下公式計算2-KGA生成量。

其中，M為I2溶液濃度(0.05 mol/L×2);V為I2溶液消耗體積(mL);A為2-KGA轉(zhuǎn)化為Vc的轉(zhuǎn)化率(%)(以63.1%計算);B為所取發(fā)酵液體積(mL);0.907 2為Vc分子量/2-KGA分子量;0.088 06為1 mL I2溶液相當(dāng)于8.806 mg Vc［6］。

1.2.3 響應(yīng)面分析使用Design-Expert軟件進行響應(yīng)面設(shè)計及分析［7-8］。

1.2.4 試驗設(shè)計①單因素試驗設(shè)計:其他因素不變，對發(fā)酵培養(yǎng)基主要營養(yǎng)物質(zhì)L-山梨糖、尿素、玉米漿、碳酸鈣分別設(shè)計5水平的單因素試驗，接種后，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，每組重復(fù)3次，測定2-KGA含量，并計算糖酸轉(zhuǎn)化率，分析各因素對混菌發(fā)酵產(chǎn)酸的影響;②Plackett-Burman試驗設(shè)計:除碳源、氮源外，混菌生長產(chǎn)酸還需要多種無機鹽及生長因子，利用Plackett-Burman試驗可有效篩選對產(chǎn)酸影響顯著的因素，進行響應(yīng)面優(yōu)化。根據(jù)文獻記載［9-10］，選擇L-山梨糖、尿素、玉米漿、KH2PO4、MgSO4、CaCO36個因素作為考察對象，設(shè)計12組的Plackett-Burman試驗，接種后，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測定2-KGA含量，重復(fù)3次，分析數(shù)據(jù)篩選顯著影響因子，各因素水平選擇見表1;③響應(yīng)面試驗設(shè)計:篩選出顯著影響因子后，以L-山梨糖、尿素、玉米漿濃度為自變量，2-KGA產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計法設(shè)計3因素3水平的17組試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以產(chǎn)酸量最大值對應(yīng)的各因素濃度作為自變量中心點，利用公式xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼，其中xi為自變量編碼值，Xi為自變量真實值，X0為中心點處自變量真實值，ΔX為自變量變化步長，編碼水平見表2。發(fā)酵液接種后，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測定2-KGA含量，重復(fù)3次，進行響應(yīng)面分析。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同伴生菌對產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的影響

以實驗室篩選的短小芽胞桿菌HJ-04和工業(yè)生產(chǎn)用菌株巨大芽胞桿菌B2980作為伴生菌分別與氧化葡萄糖酸桿菌搭配，測定發(fā)酵產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)量隨時間變化(圖1)。結(jié)果顯示，HJ-04與B2980相比能夠更好的促進產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量提高26%，產(chǎn)酸終點提前12 h，具有重要應(yīng)用價值，為進一步提高2-KGA產(chǎn)量，對新組合菌系發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

圖1 不同伴生菌對產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of different strains on

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素分析

單因素試驗結(jié)果顯示，作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源及產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的底物，增加L-山梨糖濃度可增大2-KGA產(chǎn)量，但轉(zhuǎn)化率相應(yīng)降低，發(fā)酵終點延后，發(fā)酵成本增加，且高濃度L-山梨糖抑制2-KGA的合成［11］(圖2)。

尿素作為培養(yǎng)基中的氮源及pH調(diào)節(jié)劑參與菌體的生長及代謝，隨尿素濃度的增加產(chǎn)酸量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，尿素濃度過高，明顯抑制產(chǎn)酸(圖3)。

圖2 L-山梨糖濃度對新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of L-sorbose concentration on

圖3 尿素濃度對新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of urea concentration on

圖4 玉米漿濃度對新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of corn steep liquor concentration on

玉米漿含有菌體生長所需的氨基酸、微量元素和天然物質(zhì)，是產(chǎn)酸菌生長和產(chǎn)酸不可缺少的組分［12］。隨玉米漿濃度的增加產(chǎn)酸量上升，達到一定濃度后受其他營養(yǎng)物質(zhì)限制積累量不再提高(圖4)。

已知伴生菌適合在偏堿性環(huán)境下生長，CaCO3的主要作用是中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸，避免pH過低抑制伴生菌生長進而影響產(chǎn)酸菌生長與產(chǎn)酸，適量的碳酸鈣能夠促進混合菌系發(fā)酵產(chǎn)酸(圖5)。

圖5 碳酸鈣濃度對新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.5 Effect of CaCO3concentration on

2.3 顯著影響因子的篩選

Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and result of Plackett-Burman

對試驗結(jié)果進行分析，各因素正負(fù)效應(yīng)及顯著性評價見表4，數(shù)據(jù)表明:在所選水平中，L-山梨糖、尿素、玉米漿為正效應(yīng)因素，增大其濃度促進產(chǎn)酸，KH2PO4、MgSO4、CaCO3為負(fù)效應(yīng)因素，濃度過高抑制產(chǎn)酸。依據(jù)顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)(P＜0.05)，L-山梨糖、尿素、玉米漿均為顯著影響因子，因此選擇此3因素進行響應(yīng)面優(yōu)化。

表4 各因素效應(yīng)及顯著性Table 4 Stdized effects and p-value

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken試驗3因素3水平17組的Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，其中12組試驗為析因點，自變量取值在x1、x2、x3所構(gòu)成的三維頂點，其余5組試驗為零點，自變量取中心點，用以估計試驗誤差。

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and result of Box-Behnken design

2.4.2 回歸方程的方差分析對Box-Behnken

試驗結(jié)果進行二次多項回歸擬合，得到回歸方程:

轉(zhuǎn)化為真實值得到方程:Y=-369.621 25

其中Y為2-KGA產(chǎn)量預(yù)測響應(yīng)值，x1、x2、x3為L-山梨糖、尿素、玉米漿編碼值，X1、X2、X3為L-山梨糖、尿素、玉米漿真實值。

對回歸模型方程(1)進行方差分析(表6)可知:二次回歸模型極顯著(P＜0.000 1)。失擬項F=2.44，P=0.204 8＞0.1，失擬項不顯著，說明模型與試驗不相符的概率較低，模型可信。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.978 9，說明預(yù)測值與真實值之間有良好的擬合度，信噪比為16.192(＞4)，模型可用于預(yù)測。

分析模型一次項、二次項、交互項可知:一次項x1、x2、x3和二次項、、對產(chǎn)酸量影響均顯著(P＜0.05);交互項中，x1x3最為顯著，x1x2次之，x2x3不顯著，說明L-山梨糖與玉米漿、L-山梨糖與尿素對產(chǎn)酸量均會產(chǎn)生交互影響，尿素與玉米漿交互作用較小。

2.4.3 響應(yīng)面交互作用及優(yōu)化固定3因素之一在中心點，根據(jù)方程(2)做另外2因素對2-KGA產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖(圖6～8)。由圖可見，各因素曲面坡度均較陡，說明L-山梨糖、尿素、玉米漿對2-KGA產(chǎn)量影響顯著，且產(chǎn)酸量都呈先升后降趨勢，與單因素試驗結(jié)果一致。L-山梨糖與尿素對2-KGA產(chǎn)量的交互影響如圖6所示。尿素濃度較低時增加L-山梨糖濃度對2-KGA產(chǎn)量影響較小，產(chǎn)酸量較低，說明尿素供應(yīng)不足嚴(yán)重抑制產(chǎn)酸，尿素濃度達到11 g/L以上，L-山梨糖方向曲面變陡，此時碳源及底物成為影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵因素，且隨L-山梨糖濃度增大，高濃度尿素對產(chǎn)酸的抑制作用減弱。固定尿素濃度在中心點，考察L-山梨糖與玉米漿的交互作用(圖7)可知:L-山梨糖與玉米漿均處于較低濃度時，對產(chǎn)酸抑制明顯，此時增加二者任一濃度都可有效提高2-KGA產(chǎn)量，推測二者含有混菌產(chǎn)酸所必須的類似營養(yǎng)物質(zhì);當(dāng)玉米漿濃度小于14 g/L時，增加L-山梨糖濃度可持續(xù)提高產(chǎn)酸量，玉米漿濃度達到14 g/L以上，高濃度L-山梨糖對產(chǎn)酸呈現(xiàn)抑制作用，即高濃度L-山梨糖與高濃度玉米漿共同抑制產(chǎn)酸。

尿素與玉米漿交互作用對2-KGA產(chǎn)量的影響見圖8。圖中曲面較規(guī)則，等高線中心近似圓形，交互作用不明顯。

曲面圖均有最高點，求導(dǎo)方程(2)可知響應(yīng)值存在極值點，此時L-山梨糖、尿素、玉米漿濃度分別為94.95、11.99、14.13 g/L，極值點處2-KGA預(yù)測產(chǎn)量為75.742 3 g/L。

2.5 優(yōu)化結(jié)果驗證

采用響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基(L-山梨糖94.95 g/L、尿素11.99 g/L、玉米漿14.13 g/L、KH2PO41 g、MgSO40.2 g、CaCO35 g)進行搖瓶發(fā)酵，重復(fù)3次，測定2-KGA含量隨時間變化曲線(圖9)，48 h達產(chǎn)酸終點，2-KGA平均產(chǎn)量76.9 mg/mL，與模型預(yù)測結(jié)果基本一致。相比優(yōu)化前2-KGA產(chǎn)量提高12.31 mg/mL，產(chǎn)酸終點提前，產(chǎn)酸周期縮短約6 h，原料利用率提高，節(jié)約了發(fā)酵時間及成本。

圖9 優(yōu)化前后新菌系2-KGA產(chǎn)量隨時間變化曲線Fig.9 Time-course of 2-keto-L-gulonic acid production of new strains before and after optimization

3 討論

以短小芽胞桿菌HJ-04作為Vc二步發(fā)酵中的伴生菌，國內(nèi)外未見報道，豐富了伴生菌菌種資源。HJ-04促進產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的能力明顯強于工業(yè)生產(chǎn)用菌株—巨大芽胞桿菌B2980，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后，新組合菌系產(chǎn)酸量進一步提高，產(chǎn)酸周期縮短，具有廣闊應(yīng)用前景。

多種因素相互作用對混菌發(fā)酵產(chǎn)酸會產(chǎn)生不同程度的影響，考察單因素對產(chǎn)酸的影響缺乏交互信息，響應(yīng)面法可精確考察各因素對響應(yīng)值的綜合作用。作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源及產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的底物，L-山梨糖濃度對2-KGA產(chǎn)量影響顯著;尿素作為培養(yǎng)基中的無機氮源及pH調(diào)節(jié)劑，供應(yīng)不足嚴(yán)重影響產(chǎn)酸;玉米漿含有菌體生長所需的多種天然物質(zhì)，是產(chǎn)酸菌生長和產(chǎn)酸不可缺少的組分;CaCO3通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH影響產(chǎn)酸。L-山梨糖、尿素、玉米漿是影響產(chǎn)酸的顯著因素，對2-KGA合成有交互作用:增加L-山梨糖濃度可減弱高濃度尿素對產(chǎn)酸的抑制，高濃度L-山梨糖與高濃度玉米漿共同抑制產(chǎn)酸。響應(yīng)面優(yōu)化后確定L-山梨糖、尿素、玉米漿最佳濃度分別為94.95、11.99、14.13 g/L，48 h發(fā)酵終點2-KGA產(chǎn)量達到76.9 mg/mL，與預(yù)測吻合，模型可靠。

［1］ 戴偉國.中國維生素C生產(chǎn)現(xiàn)狀，動態(tài)及對策［J］.上海醫(yī)藥，2003，24(10):460-461.

［2］ 尹光琳，陶增鑫，于龍華，等.L-山梨糖發(fā)酵產(chǎn)生維生素C前體2-酮基-L-古龍酸的研究［J］.微生物學(xué)報，1980，20(3):246-251.

［3］ 宋文新，邵慶均.維生素C二步發(fā)酵合成法的研究進展［J］.中國飼料，2008，(19):9-12.

［4］ 李義，周彬，劉耀平，等.二步發(fā)酵新組合菌系的研究［J］.微生物學(xué)通報，2002，22(2):26-32.

［5］ 劉志祥，曾超珍.響應(yīng)面在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.北方園藝，2009，(2):127-129.

［6］ 牛建雙，呂淑霞，趙朔，等.玉米漿對Vc二步發(fā)酵產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸影響的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(2):29-31.

［7］ 方妍煜，馮志彬，張玉香，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化丹貝固體發(fā)酵條件［J］.食品工業(yè)科技，2009，(4):168-170.

［8］ Zhu Tao，Heo Hyojung，Row Kyungho.Optimization of crude polysaccharides extraction from Hizikia fusiformis using response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2010，82(1):106-110.

［9］ 李強，刁勁羽，向波濤.山梨糖發(fā)酵產(chǎn)生2-酮基-L-古龍酸氮源代謝規(guī)律［J］.微生物學(xué)報，1996，36(1):19-24.

［10］ 路新利，趙士豪，李寶庫.維生素C二步發(fā)酵菌發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品科技，2008，(3):34-38.

［11］ 路新利，馬珦玻，趙士豪，等.山梨糖流加發(fā)酵高效生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸［J］.中國食品添加劑，2005，3:33-36.

［12］ Zhang Jing，Zhou Jingwen，Liu Jie，et al.Development of chemically defined media supporting high cell density growth of Ketogulonicigenium vulgare and Bacillus megaterium［J］.Bioresource Technology，2011，102(7):4807-4814.