顧亮，丁磊

（安徽國家農業(yè)標準化與監(jiān)測中心，合肥 230051）

液相色譜串聯(lián)質譜法測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A

顧亮，丁磊

（安徽國家農業(yè)標準化與監(jiān)測中心，合肥 230051）

利用液相色譜串聯(lián)質譜（LC-ESI-MS/MS）測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A。通過一系列實驗對樣品前處理條件進行了優(yōu)化，樣品經乙腈提取、乙酸酸化、凈化后，采用HPLC-ESI-MS/MS檢測分析，在多反應監(jiān)測模式（MRM）下，外標法定量。方法的檢出限為0.05 mg/kg，各組分濃度在0.001～0.2 mg/kg范圍內與定量離子峰面積呈良好的線性關系（r＞0.99）。平均加標回收率為61%～75%，測定結果的相對標準偏差為2.78%～4.37%(n=6)。該方法簡便、準確，各項技術指標均滿足國內外有關飼料中瘦肉精檢測要求，可用于飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A殘留的分析測定。

鹽酸克倫特羅；萊克多巴胺；沙丁胺醇；苯乙醇胺A；高效液相色譜-串聯(lián)質譜；飼料

β-受體激動劑屬于苯乙胺類藥物，能減緩或減少脂肪沉積，增加肌肉蛋白沉積，使營養(yǎng)重新分配，從而顯著提高動物酮體的瘦肉率、增重和提高飼料轉化率。因此，β-受體激動劑被大量非法用于畜牧生產，其中最常用的有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。長期食用含有β-受體激動劑殘留的食品將對人體健康產生極大的危害,可誘發(fā)和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、臉、頸部骨骼肌震顫;另外還能引起代謝紊亂，對糖尿病人可發(fā)生酸中毒或酮中毒。

近年來，一些新型的β-受體激動劑藥物被發(fā)現(xiàn)用于畜牧生產中，例如苯乙醇胺A等，為了保護人們的身體健康，必須從各個環(huán)節(jié)上確保畜產品的安全。開展飼料及飼料添加劑中克倫特羅和萊克多巴胺等β-興奮劑的檢測是從源頭進行控制的有效手段。因此研究飼料中克倫特羅和萊克多巴胺等β-興奮劑含量的檢測方法具有重要的意義。中國衛(wèi)生部、農業(yè)部、國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的第176號公告（2002）和第1519號公告（2010）《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A，國際上大多數國家規(guī)定禁用這些β-興奮劑類物質。

目前檢測飼料中β-興奮劑類物質的方法主要為高效液相色譜串聯(lián)質譜法，檢測物質多為鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺，同時檢測飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A尚未見報道，因此筆者對利用液相色譜串聯(lián)質譜（LC-ESI-MS/MS）同時測定飼料中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A進行了研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質譜儀：6410Triple Quad LC/MS型，美國安捷倫公司；

離心機：Z-323 K型,德國HERMLE 公司；

氮吹儀：N-EVAP 12型，美國Organomation公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

混勻器：MS 3basic型，德國IKA公司；

去離子水發(fā)生器：M illi-Q型，美國M illipore公司；

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸：色譜純，美國Tedia公司；

實驗用水：M illi-Q去離子高純水；

有機微孔過濾膜：孔徑0.22 μm；

聚丙烯離心管：50m L；

鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A標準品：德國Dr. E公司。

1.2 儀器分析條件

（1）液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（50mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：35℃；流速：0.30m L/m in ；進樣量：10μL ；流動相：0.1% 甲酸水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

（2）質譜分析條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11 L/m in；霧化器壓力：289.6 kPa（42 Psi）；毛細管電壓：4 000V ；對于所有的目標化合物，其最佳的碰撞電壓以及相應的定性離子對、定量離子對見表2。

表2 多反應監(jiān)測（MRM）條件

在上述液相色譜、質譜條件下，4種β-興奮劑類物質總離子色譜圖見圖1。

圖1 4種β-興奮劑類物質總離子色譜圖

1.3 樣品前處理

（1）提取

稱取5 g粉碎試樣（精確至0.01 g）于50m L具塞塑料離心管中，加入10m L含5%甲酸的水-乙腈混合溶液（體積比1∶2），室溫下水浴超聲20m in后，以10000r/m in離心10m in，取上清液，備用。

（2）凈化

固相萃取柱（PCX）先用3 m L甲醇、3 m L水活化，將上清液過柱，依次用3 m L水、3 m L甲醇淋洗，抽干5 m in，用5%氨水甲醇溶液5 m L洗脫，收集洗脫液于50℃水浴中用氮氣緩慢吹干后用流動相定容至 1.0m L，過 0.22 μm 微孔濾膜，供儀器檢測。

2 結果與討論

2.1 樣品提取條件優(yōu)化

目前動物源性食品中的β-興奮劑類物質殘留檢測的提取液多為2.0mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH 5.2）、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，且需要37℃恒溫水浴過夜，上述方法不適用于飼料中β-興奮劑類物質的檢測，因為飼料中的β-興奮劑類物質多為非法添加，不像動物源性食品中殘留的β-興奮劑類物質已經同動物體內的蛋白質發(fā)生軛合反應和蛋白質結合等作用。因此在選擇樣品提取溶液時沒有考慮上述提取溶劑，在參考其它文獻的基礎上選擇了5%甲酸水-乙腈作為提取溶劑，通過優(yōu)化兩者之間的體積比例獲得最高回收率，實驗最終選擇5%甲酸水－乙腈（體積比1∶2）作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

根據β-受體激動劑苯環(huán)上取代基的差異，可分為苯胺型和苯酚型。克倫特羅屬于苯胺型結構，軛合反應率和蛋白結合率低，其余為苯酚型。由于獸藥殘留基質的復雜性，在檢測前一般需對提取液進行凈化。常見的凈化技術主要是液-液分配和固相萃取，其中液-液分配對苯胺型凈化效果較好，但由于苯酚型極性相對較高，回收率低，因此實驗采用混合型固相萃取柱PCX－固相萃取凈化樣品。

2.3 儀器條件的選擇

在LC-MS/MS分析中，色譜的分離和質譜數據的采集是同時進行的，為了使每個組分都能得到分離和鑒定，以獲得最大的靈敏度，必須設置合適的色質分析條件，特別是質譜條件。

色譜條件包括色譜柱類型、流動相組成、流動相大小、柱溫等。質譜條件包括離子源、離子化模式、離子源溫度、霧化氣流量、質量掃描范圍、定量檢測模式等，這些都要根據樣品情況進行設定。通過試驗優(yōu)化的儀器分析條件見表1、表2。

2.4 工作曲線方程與檢出限

在優(yōu)化條件下，配制一系列不同濃度的混合標準溶液進行測定，以各組分定量離子的峰面積對濃度繪制標準曲線，線性關系和相關系數見表3。結果表明，在 0.001～0.2 mg/kg 范圍內，4 種 β-興奮劑類物質的質量濃度（X）與定量離子的峰面積（Y）呈良好的線性關系。對不含瘦肉精的空白樣品進行測定，以10倍信噪比計算方法的檢出限為0.05mg/kg。

2.5 精密度和回收試驗

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，分別

表3 工作曲線方程、線性范圍、相關系數、檢出限

對不同飼料樣品中4種β-興奮劑類物質進行5個水平的添加回收試驗，每個水平進行6次重復試驗，試驗結果見表4。由表4可知，回收率為61%～75%，6次測定結果的相對標準偏差為2.78%～4.37%。

表4 回收試驗結果(n=6)

3 結語

建立了液相色譜串聯(lián)質譜（HPLC-ESI-MS/MS）法，并快速、準確地測定了飼料中4種β-興奮劑類物質殘留量。該方法具有快速、靈敏、準確和操作簡單的特點，能夠很好地應用于各種飼料中β-興奮劑類物質的分析檢測。

［1］Yang Y T，Ecellgo tt M a.M u ltip le action o f ad renergic agonistsonskeletal muscle and adipose tissue[J]. Biochem istry，2000，261:1-10.

［2］Li Junsuo，Qiu Yuem ing，Wang Chao. Residue analysis for veterinary drug[M].Shanghai：Shanghai Scientific & Technical Publishers，2002:641-658.

［3］高燕紅，吳西梅.液質聯(lián)用快速測定飼料中的萊克多巴胺和克倫特羅 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15 (6):643-645.

Determ ination of Clenbuterol Ractopam ine Salbuterol and Nylethanolam ine in Feeds by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem M ass Spectrometry

Gu Liang，Ding Lei
（National Center of Agricultural Standarlization and Supersion，Hefei 230051，China）

A new method was developed for the determ ination of clenbuterol, ractopam ine, salbuterol and phenylethanolam ine A by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.Sample preparation and HPLC-MS/MS analytical conditions were examined and optimized critically by use of a series of experiments study. Samples were extracted by acetonitrile，then cleaned up，and analyzed qualitatively and quantitatively by LC-ESI-MS/MS. The method detection lim it （LOD）was 0.05 mg/kg. Element concentration was linear w ith peak area in the range of 0.001-0.2 mg/kg（r ＞ 0.99）. The average recoveries ranged from 61% to 75%. The method is simple，effi cient，accurate and can meet the requirements of determination for clenbuterol，ractopamine，salbuterol and phenylethanolamine A in feeds.

clenbuterol; ractopam ine; salbuterol; phenylethanolam ine A; liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; feed

O657.99

A

1008-6145(2012)01-0037-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.011

聯(lián)系人：丁磊；E-mail:dinglei8@126.com

2011-10-12