成希飛，李昀鍇，向明霞，徐明芳

（廣州暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣州 510632）

兩種快速分離檢測南方水牛乳乳清蛋白方法的比較

成希飛，李昀鍇，向明霞，徐明芳

（廣州暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程系，廣州 510632）

采用了毛細(xì)管電泳法（CE）和反相高效液相色譜法（RP-HPLC）兩種方法對(duì)乳源乳清蛋白進(jìn)行分離檢測。結(jié)果表明：兩種方法都能夠有效分離乳清蛋白中的BSA，α-La，β-Lg，并能對(duì)各種蛋白進(jìn)行定性定量分析。相比而言，毛細(xì)管電泳法分離更加快速，整個(gè)分離過程7 min左右即可完成，能分離出IgG組分。而RP-HPLC分離時(shí)間更長，需要45 min才能完全分離，并且無法分離出IgG組分。

毛細(xì)管電泳法；RP-HPLC；牛奶；乳清蛋白

0 引言

水牛乳蛋白和脂肪含量高，還富含鋅、鐵等礦物質(zhì)元素，具有脂肪直徑大，酸度小，易吸收等特點(diǎn)[1-2]。水牛乳非蛋白氮含量較低，含有寡糖，具有免疫調(diào)節(jié)作用[3-4]。

近年來高效液相色譜（HPLC）和毛細(xì)管電泳（CE）的發(fā)展為蛋白質(zhì)和多肽的分離分析提供了新的手段。CE法在乳蛋白檢測[5-6]、遺傳變異體及處理方法對(duì)乳蛋白含量變化[7]的研究中被廣泛應(yīng)用。唐萍[8]、劉婷[9]等采用檸檬酸緩沖體系對(duì)乳蛋白進(jìn)行研究并取得了較好的結(jié)果。HPLC法在氨基酸、多肽、糖類及蛋白質(zhì)的分離和定量分析上應(yīng)用廣泛，目前RP-HPLC在乳品中的蛋白分離分析、摻假[10-11]、變異體等[12-13]方面已有廣泛的研究。

本文采用CE及RP-HPLC兩種方法對(duì)水牛乳乳清蛋白進(jìn)行分離檢測，并與荷斯坦奶乳清蛋白進(jìn)行差異性分析。CE法分離效果更好，分離時(shí)間更短。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器、試劑及材料

材料及試劑：荷斯坦鮮牛奶、水牛奶（均為巴氏殺菌奶，市售）；α-乳白蛋白（α-lactalbumin,α-La，L6010）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg，L3908）、免疫球蛋白（IgG,HA010,sigma公司）、BSA（純度≥96%，北京欣普森生物科技有限公司）；乙腈及三氟乙酸（色譜純）；Millipor純水。SDS純度＞99%、聚乙二醇(PEG4000)，羥丙基甲基纖維素，其他試劑均為分析純。

儀器：P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀；PHS-3C pH計(jì)；Agilent 1100型HPLC色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺(tái)；KDC-2046型冷凍離心機(jī)；CP224C型電子天平。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白的提取

新鮮牛乳以4 000 r/min（4℃）離心25 min，除去乳脂，吸出清液。用濃度為5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為4.6，靜置30 min，以4 000 r/min（4℃）離心20 min，棄去沉淀，清液0.22 μm濾膜過濾備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

α-La，β-Lg，BSA，IgG溶于蒸餾水分別配制成終質(zhì)量濃度為10，9.6，10.1，2.0 g/L的儲(chǔ)液，0.22 μm濾膜過濾備用。

1.2.3 緩沖液的配制硼砂電泳緩沖液

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%硼砂，濃度為1 mol/L硼酸調(diào)pH值，定容至25 mL，0.22 μm濾膜過濾備用.

1.2.4 毛細(xì)管電泳操作條件

毛細(xì)管電泳測定條件:毛細(xì)管柱溫25℃;檢測波長214 nm;壓力進(jìn)樣(3.9 KPa)，進(jìn)樣時(shí)間5 s；運(yùn)行電壓25 kV；柱清洗：每次進(jìn)樣前分別用水洗5 min和緩沖液沖洗3 min。每次分離后用濃度為0.1 mol/L的NaOH沖洗2 min。

1.2.5 反相高效液相色譜條件

Agilent 1100高效液相色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺(tái)1100,包括自動(dòng)進(jìn)樣器、光電二極管陣列檢測器(DAD)、柱溫箱、進(jìn)樣瓶、渦漩振蕩器、針管過濾器、0.45 μm尼龍濾膜；RP-HPLC色譜柱Jupiter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，孔徑：300A)。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸（TFA）水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的TFA的乙腈溶液。洗脫梯度：0～9 min為3%～35%B；9～18 min為37%～40%B；18～22 min為40%～41%B；22～27.5 min為41%B；27.5～28 min為41%～43%B；28～36 min為43%～45%B；36～40 min為45%～90%B；柱溫為20℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為214 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管電泳及RP-HPLC色譜結(jié)果

2.1.1 乳清蛋白混合標(biāo)樣毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳條件：電泳緩沖液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的SDS，1.2%硼砂，pH值為8.95，電壓25 kV，溫度25℃。圖1為乳清蛋白混合標(biāo)樣毛細(xì)管電泳結(jié)果。由圖1可以看出，本文所采取的毛細(xì)管電泳條件可以有效地將乳清蛋白混合標(biāo)樣的各個(gè)組分完全分開，出峰順序依次為IgG，BSA，β-Lg，α-La，且分離效果良好。

2.1.2 RP-HPLC色譜

圖2為乳清蛋白混合標(biāo)樣高效液相色譜圖。由圖2可以看出，在1.2.5色譜條件下，乳清蛋白標(biāo)樣高效液相色譜圖出峰蛋白依次為BSA，α-La，β-Lg。最早被洗脫下來的BSA與雜質(zhì)能完全分離，分離效果較好。結(jié)果表明，在該色譜條件下進(jìn)行乳清蛋白單體的分離是可行的。

2.2 乳源乳清蛋白組分的分離及差異性分析

2.2.1 水牛奶乳清蛋白的毛細(xì)管電泳分析

水牛奶含有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其大多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)比荷斯坦奶牛、人母乳、黃牛奶更豐富，較為適合制作多種優(yōu)質(zhì)奶產(chǎn)品。

由圖3（a）可以看出，水牛奶乳清蛋白BSA，β-Lg，α-La在該電泳條件下的遷移時(shí)間分別為6.19，6.56，6.69 min；IgG的兩個(gè)遷移時(shí)間分別為5.17 min和5.26 min。另外，β-Lg的峰面積大于α-La的峰面積，即β-Lg的含量高于α-La。荷斯坦牛奶乳清蛋白的BSA、β-Lg、α-La的遷移時(shí)間為6.11 min、6.31 min、6.43min，IgG的兩個(gè)遷移時(shí)間分別為5.29 min、5.36 min（圖3b），β-Lg的峰面積與α-La的峰面積相差極大，即β-Lg的含量遠(yuǎn)低于α-La的質(zhì)量濃度，原因可能是在牛奶進(jìn)行加工時(shí)因所采用的處理方法而造成β-Lg蛋白質(zhì)量濃度的減少。水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶的乳清蛋白在遷移時(shí)間上有顯著不同，同時(shí)由表1看出，兩種牛奶的乳清蛋白中4種主要成分蛋白的含量也有所不同，水牛奶乳清蛋白的主要成分的質(zhì)量濃度高于荷斯坦牛奶中乳清蛋白的質(zhì)量濃度。

表12 種牛奶乳清蛋白的質(zhì)量濃度g/L

綜上可見，水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶的乳清蛋白有顯著差異性，分析原因：水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶乳清蛋白在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)上有所不同，從而造成蛋白在高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量及所帶電荷的不同，以致各蛋白在進(jìn)行毛細(xì)管電泳時(shí)的荷質(zhì)比不同，表觀體現(xiàn)在蛋白的遷移時(shí)間的不同。

2.2.2 水牛奶乳清蛋白的RP-HPLC色譜分析

圖4為水牛奶、荷斯坦牛奶乳清蛋白的RP-HPLC色譜分離圖結(jié)果。由圖4可以看出，乳清蛋白在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下的出峰順序依次為：BSA，α-La，β–Lg。由圖4(a)水牛奶乳清蛋白的色譜圖可知，BSA的出峰時(shí)間為18.91 min。α-La在19.97 min有一個(gè)峰，表明α-La成分單一無遺傳變異體，β-Lg有3個(gè)峰說明β-Lg有3種遺傳變異體，其出峰時(shí)間分別為28.34 min、32.1 min、33.30 min。由圖4(b)可知，荷斯坦牛奶BSA在19.03min，α-La在20.05 min各有一峰，表明α-La成分單一無遺傳變異體，β-Lg在29.20 min和32.20 min有兩個(gè)變異體峰。同時(shí)由表2看出，兩種牛奶的乳清蛋白中3種主要成分蛋白的含量也有所不同。

綜上所述，水牛奶乳清蛋白與荷斯坦牛奶乳清蛋白在出峰時(shí)間及蛋白變異體上都有顯著的差異性，分析原因：水牛奶乳清蛋白與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)上有所不同，從而造成蛋白在高級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量、所帶電荷及蛋白的極性有所不同，在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，蛋白隨洗脫液的疏水性的改變而逐步被洗脫，從而表現(xiàn)在出峰時(shí)間上有所不同。

表22 種牛奶乳清蛋白的質(zhì)量濃度g/L

3 結(jié)論

毛細(xì)管電泳法能有效分離檢測乳清蛋白中的BSA，β-Lg，α-La，IgG 4種組分。結(jié)果表明，水牛奶乳清蛋白在遷移時(shí)間上與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白的遷移時(shí)間及蛋白質(zhì)量濃度有明顯差異。RP-HPLC法能有效分離檢測乳清蛋白中的BSA，β-Lg，α-La 3種組分。從保留時(shí)間和蛋白含量兩個(gè)方面分析了水牛奶乳清蛋白與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白的差異性，水牛奶乳清蛋白在保留時(shí)間上與普通荷斯坦牛奶乳清蛋白的保留時(shí)間有明顯差異，且水牛奶乳清蛋白α-La無變異體，β-Lg有3個(gè)變異體，與荷斯坦奶有明顯差異。

本文采用毛細(xì)管電泳和RP-HPLC兩種方法都能將乳源乳清蛋白中的組分分開，但是毛細(xì)管的分辨率更好，能將乳中的4種組分（BSA，β-Lg，α-La，IgG）分開，RP-HPLC沒有檢測到IgG峰。并且毛細(xì)管電泳的分離時(shí)間更短，7 min左右即可分離完全，而RPHPLC需要45 min。對(duì)比兩種方法的峰形，可以看出毛細(xì)管電泳的峰寬比RP-HPLC的峰寬窄，說明毛細(xì)管電泳方法分離效率更高。

[1]SPANGHERO M,SUSMEL P.Chemical Composition and Energy Content of Buffalo Milk[J].J.Dairy Res.,1996,63(4):629-633.

[2]HUPPERTZ,ZOBRIST MR,UNIACKE T,et al.Effects of High Pressure on Some Constituents and Properties of Buffalo Milk[J].J Dairy Res,2005,72(2):226-233.

[3]BARAKAT MZ,SHEHAB SK,NAGUIB N.A Study of The Calcium-PhosphorusRatioofDifferentMilks[J].Zentralbl Veterinarmed A,1969,16(5):444-449.

[4]MEDRANO JF,SHARROW L.Milk Protein Typing of Bovine MammaryGlandTissueUsedtoGenerateaComplementary Deoxyribonucleic Acid Library[J].J Dairy Sci,1989,72(12):3190-3196.

[5]TORRE P,BARCINA Y.Validation of Capillary Electrophoresis in The Analysis of Ewe’s Milk Casein[J].Journal of Chromatography A, 1999(832):239–246.

[6]MIRALLESB,ROTHBAUEV.ImprovedMethodforThe Simultaneous Determination of Whey Proteins,Caseins and Para-κ-Casein in Milk and Dairy Products by Capillary Electrophoresis[J]. Journal of Chromatography A,2001(915):225–230.

[7]HAM J S,JEONG S G,LEE S G.Irradiation Effect on α-and β-caseins ofMilkandQuesoBlancoCheeseDeterminedbyCapillary Electrophoresis[J].Radiation Physics and Chemistry 2009(78):158–163.

[8]唐萍,田晶.奶制品中蛋白質(zhì)測定的毛細(xì)管電泳法研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào).2006,21(6):5-8.

[9]劉婷,姜金斗,毛細(xì)管電泳檢測奶粉中添加的大豆分離蛋白[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào).2008,22(1):37-41.

[10]BONFATTI V,GRIGELETTO L,Validation of A New Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography Method for Separation and Quantification of Bovine Milk Protein Genetic Variants[J]. Journal of Chromatography A,2008(1195):101–106.

[11]BORDIN G.,RAPOSO F C.Identification and Quantification of Major Bovine Milk Proteins by Liquid Chromatography[J].Journal of Chromatography A,2001(928):63–76.

[12]TRUJILLO A J,CASALS I,Analysis of Major Bovine Milk Proteins by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography and Flow Injection Analysis With Electrospray Ionization Mass Spectrometry[J]，Journal of Chromatography A,2000(870):371–380.

[13]PALMANO K P,ELGAR D F,Detection and Quantitation of Lactoferrin in Bovine Whey Samples by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography on Polystyrene Divinylbenzene,[J]. Journal of Chromatography A,2002(947):307–311.

Contrast between two rapid separation and detection of Southern Water Buffalo whey protein methods

CHENG Xi-fei，LI Yun-kai，XIANG Ming-xia，XU Ming-fang
(Department of biotechnology,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Two methods were studied for the separation and detection of whey protein by reverse-phase HPLC(RP-HPLC)and capillary electrophoresis(CE).The results show that two methods can both separate BSA、α-La、β–Lg effectively,and both can do qualitative and quantitative analysis for different kinds of whey protein.In contrast,CE can separate more rapidly,it only used 7 minutes to complete the whole separation process while RP-HPLC needed 45 minutes,in addition,RP-HPLC cannot separate and examine the IgG component.

CE；RP-HPLC;milk;whey protein

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0055-03

2011-11-14

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No:2009B011300003），兩種快速分離檢測南方水牛乳乳清蛋白方法的比較。

成希飛（1988-），女，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物與微生物工程。

徐明芳