段玉林,蘇駿,吳雪,張少梅,溫韜,梁夢宇,陳小聰,蒙泳,周曼,宗玉英

（1.廣西產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,南寧 530022;2廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局南寧 530022;3廣西壯族自治區(qū)環(huán)境監(jiān)測中心站,南寧 530022）

高效液相色譜測定廣西生鮮乳中的維生素A

段玉林1,蘇駿1,吳雪1,張少梅3,溫韜1,梁夢宇1,陳小聰1,蒙泳2,周曼1,宗玉英1

（1.廣西產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,南寧 530022;2廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局南寧 530022;3廣西壯族自治區(qū)環(huán)境監(jiān)測中心站,南寧 530022）

為了建立生鮮乳中維生素A的一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方法，樣品經(jīng)皂化后，經(jīng)石油醚提取，濃縮后采用高效液相色譜法，以Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35℃，檢測波長325 nm，流動相為甲醇∶水（98∶2，體積比），流速1.0 mL/min的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果維生素A在0.174～87.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，平均回收率為98.17%，RSD=1.90%。建立的方法準(zhǔn)確、可靠，可以用于生鮮乳中維生素A的含量檢測。

生鮮乳；維生素A；高效液相色譜

0 引言

維生素A屬于脂溶性維生素，能夠調(diào)節(jié)人體的多種生理機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，在調(diào)節(jié)體內(nèi)各方面的代謝及促進(jìn)骨骼的生長發(fā)育上有著極其重要的作用[1]，同時它也參與視網(wǎng)膜視紫質(zhì)的合成與再生，維持正常視覺，因此常被用作營養(yǎng)素加入到食品中，特別是嬰幼兒食品中。但維生素A進(jìn)入機(jī)體后排泄效率不高，長期過量攝入可在人體內(nèi)蓄積，引起維生素A過多癥，成年人長期攝入15 000 μg視黃醇當(dāng)量，即可出現(xiàn)厭食、過度激動、惡心、嘔吐、眼底水腫等中毒癥狀[2，3-5]。而在市售的乳制品中，維生素的標(biāo)示存在標(biāo)示量與實(shí)際測量值相差懸殊、更有甚者不標(biāo)維生素A的含量等問題，如果長期食用這類食品，必然給消費(fèi)者健康造成危害。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器為日本島津LC-20AT液相色譜儀。主要試劑：視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度在99.5%以上)，甲醇（色譜純），乙醇（色譜純），水（超級純），石油醚（沸程30℃-60℃），氫氧化鉀（分析純），抗壞血酸（分析純），無水硫酸鈉（分析純），生鮮乳。

1.2 色譜條件

島津Shim-pack VP-ODS柱子（4.6mm×150mm，5 μm），流動相為甲醇∶水（98∶2，體積比）。檢測波長325 nm，柱溫35℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

稱取適量的視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取20 μL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙醇定容至10 mL，用325 nm波長、1 cm比色皿測得其平均吸光值為0.032，計(jì)算[6]出其標(biāo)準(zhǔn)儲備液中視黃醇的濃度為87.2 μg/mL。分別準(zhǔn)確吸取視黃醇的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0，0.1，1，5，10，20，25，50 mL于50 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)系列工作液質(zhì)量濃度分別是0.174，1.74，8.72，17.44，34.88，43.60，87.2 mg/L。

1.4 樣品處理

稱取搖勻后的試樣約50 g（精確至0.1 mg）至250 mL三角瓶中，加入100 mL抗壞血酸的乙醇溶液（質(zhì)量濃度15 g/L），搖勻后加入25 mL氫氧化鉀的水溶液（質(zhì)量濃度1 250 g/L），放在恒溫磁力攪拌器（水溫控制在53℃）上皂化45 min；冷卻后用石油醚反復(fù)提取皂化液，用水洗至中性后，將用無水硫酸鈉脫水后的提取液減壓蒸至近干，用氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法

維生素A是一種不穩(wěn)定的有機(jī)化合物，受貯存時間、溫度、光照等因素影響較大[7]，這對維生素A的測定帶來一定的難度，所以在樣品前處理時要采取避光、縮短做樣時間等措施以提高其測量準(zhǔn)確度。本方法較國家標(biāo)準(zhǔn)[GB5413.9-2010]中減少了提取液蒸干后定容分取步驟，提取液蒸至近干后直接用氮?dú)獯蹈?，再加甲醇直接溶解，這樣不但簡化了樣品處理步驟，節(jié)省了試驗(yàn)時間，同時也避免了定容分取引起的測量誤差。為了比對采用不同標(biāo)準(zhǔn)的處理方法[6，8]而引起的測量差別，筆者采用同一生鮮乳進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：

表1 不同條件下測定生鮮乳中的維生素A測量結(jié)果μg/100g

由表1可以看出，沸水浴回流皂化程度較完全，萃取時采用注射器抽取可降低使用分液漏斗時的萃取液損失，減少測定誤差，由此我們可以在測量維生素A采取沸水浴回流皂化、注射器抽取分液的樣品處理措施。改進(jìn)后方法較國標(biāo)方法測量準(zhǔn)確度更高，同時此方法作為非標(biāo)方法也可以縮短檢驗(yàn)時間，提高檢測效率，在檢測機(jī)構(gòu)中作為非標(biāo)方法可以推廣使用。

2.2 檢測波長與流動相的選擇

視黃醇在325 nm處有比較強(qiáng)的吸收[8]，測定維生素A時檢測波長選325 nm；流動相甲醇中加入水后分離程度較好，但分析時間加長，本文用甲醇：水（98:2，體積比）作流動相[1，8，9]。

2.3 線性關(guān)系及儀器檢出限

取質(zhì)量濃度為0.174，1.74，8.72，17.44，34.88，43.60，87.2 mg/L系列溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰峰面積，以峰面積與濃度作線性回歸，得色譜條件下維生素A的線性回歸方程為Y=81912X-11937，r= 0.9999。圖3結(jié)果表明，維生素A在0.174～87.2 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與質(zhì)量濃度之間具有較好的線性關(guān)系，以信噪比為3時測得最低檢出限量為1.88×10-9μg（響應(yīng)值N=5×10-3，以峰面積為縱坐標(biāo)，以維生素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)得Y=8×106X-6502.3，b=8×106，檢出限為3 N/b）。不斷地稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液，當(dāng)質(zhì)量濃度稀釋到0.05 μg/L時還有檢測信號，再向下稀釋時信號不明顯，得出該方法的最低檢出限為0.05 μg/L。

2.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為87.2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)10 μL，測得峰面積值的平均值為7140345，RSD=0.10%（表2）。

表2 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為87.2 mg/L的標(biāo)液1 mL，加入到50.00 g空白樣品中（該樣品的維生素A 3次測定后平均值為45.8 μg/100 g，造化提取后過0.45 μm濾膜，平行測定5次，得其標(biāo)準(zhǔn)平均回收率為98.17%，RSD= 1.90%。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)

2.6 水牛與花白牛產(chǎn)的生鮮乳中維生素A的比較

為了掌握生鮮乳中維生素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)區(qū)別，筆者就廣西不同牧場的水牛及花白奶牛所產(chǎn)的生鮮乳進(jìn)行連續(xù)3 d的測定，測定結(jié)果如表4所示。

表4 生鮮乳中維生素A的測定μg/100g

由表4可以看出，同一頭奶牛所產(chǎn)的生鮮乳中維生素A的含量是穩(wěn)定的；整體上水牛所產(chǎn)的生鮮乳中比花白牛的高，由于個體差異，個別花白牛也有比水牛的高；由于農(nóng)戶散養(yǎng)的水牛在飼料及其他條件上比牧場飼養(yǎng)的條件好，所產(chǎn)的生鮮乳中維生素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)就較高，綜上可以看出，生鮮乳中維生素A的含量高低不但同奶牛的品種有關(guān)，也與奶牛的飼養(yǎng)條件密切相關(guān)，同時又存在奶牛個體之間的個體差異。

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜作為生鮮乳中維生素A的檢測方法，經(jīng)過對國家標(biāo)準(zhǔn)方法[7-8]稍作改動，有利于節(jié)約試驗(yàn)時間，提高測量的準(zhǔn)確度，作為非標(biāo)方法可以在食品檢測機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用，對乳制品中維生素A的準(zhǔn)確測量將能起到積極的作用。

通過對廣西不同牧場不同品種及不同飼養(yǎng)條件下的奶牛連續(xù)進(jìn)行維生素A的測定，可以看出生鮮乳中維生素A的含量不但是有奶牛的品種所決定，更于奶牛的飼養(yǎng)條件有著很大的關(guān)系，同時也存在著奶牛的個體差異，這將對今后的奶牛的選種培育、優(yōu)化奶牛養(yǎng)殖具有重要的指導(dǎo)意思。

[1]陳春曉，劉紅河，康莉，等.強(qiáng)化食品中維生素A和維生素E的反相高效液相色譜同時測定法[J].職業(yè)與健康,2005,21(8)：1130-1132.

[2]郭建輝，劉安軍，劉有志，等.高效液相法測定鵝肥肝和鵝肝醬中維生素A[J].食品研究與開發(fā)，2006,10，119-121.

[3]李婷欣,李云.維生素A對免疫功能的影響[J].生命的化學(xué),2005,(01): 59-61.

[4]宋圃菊.中國兒童臨床維生素A缺乏[C].量營養(yǎng)素與兒童健康學(xué)術(shù)研討會論文匯編，2004.

[5]李婷欣，李云.維生素A對免疫功能的影響[J].生命的科學(xué),2005,25(1): 56-58.

[6]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 54139-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定[S].中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布，2010.

[7]關(guān)爾吉.高壓液相色譜法測定飼料添加劑多種維生素中維生素A和維生素E含量[J].獸醫(yī)藥品通訊，1987(1)：37-41.

[8]李東，蔣淑梅，袁秀娟.維生素A分析方法的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，1999,2,28-32.

[9]趙慧芬，李克杰，曹燕叔，等.高效液相色譜法同時測定強(qiáng)化牛奶中的維生素A和D2[J].色譜，1995,13（1）：61-62.

Detection of Vitamin A in the Gungxi fresh milk by performance liquid chromatography

DUAN Yu-lin1，SU Jun1，WU Xue1，ZHANG Shao-mei3，WEN Tao1，LIANG Meng-yu1，CHEN Xiao-cong1，MENG Yong2，ZHOU Man1，ZONG Yu-ying1
(1.Guanxi Product Quality Supervision and Testing Institute,Nanning 530022,China;2.Guangxi Bureau of Quality and Technical Supervision，Nanning 530022,China;3.Guangxi Environmental Protection Monitoring Central Station,Nanning 530022，China)

To establish a quick,accurate,sensitive method for analyzing Vitamin A illegally added into the fresh milk.The sample was determined after being saponified,abstracted with petroleum ether and concentrated,performance liquid chromatography was used.The column was Shim-pack VP-ODS 4.6×150 mm,column temperature was 35℃and the mobile phase was methanol:water=98:2(v:v)with flow rate 1.0 mL/min and the detective wavelength was 325 nm..The linear range of the calibrati on curve of Vitamin A were 0.174～87.2 μg/mL (r=0.9999).The mean rates of recovery was 98.17%and the relative standard deviations(n=5)was 1.90%.The method is accurate,realiable that can be used to determine Vitamin A in the fresh milk.

fresh milk；Vitamin A；performance liquid chromatography

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0058-03

2011-11-30

段玉林（1982-）,男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊ぎa(chǎn)品分析。