錢建國，吳秋麗

(1.河北辛集市第二人民醫(yī)院 河北 辛集 052360;2.天津醫(yī)科大學，天津 300192)

骨肽注射液在臨床常用于骨折和修復壞死骨治療骨質疏松等，并取得良好效果［1］，但骨肽注射液對上述病癥的治療機理研究較少，本課題研究了骨肽注射液對新生大鼠的成骨細胞生長的影響，考察其療效的可能機制。

1 材料

骨肽注射液(國藥準字 H20003923，批號:100101規(guī)格:2 mL∶10 mg)，蚌埠市宏業(yè)生化制藥廠;D-Hanks液，天津百浩生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基，上海源聚生物科技有限公司;胰蛋白酶，上海源聚生物科技有限公司;Ⅱ型膠原酶，美國Gibco公司;胎牛血清(FBS)，上海川翔生物科技有限公司;堿性磷酸酶，上?？婆d生化試劑有限公司;NBT-BCIP堿性磷酸酶檢測試劑盒，昊柏生物科技有限公司。

DNM-9602酶聯(lián)免疫檢測儀，上海京工實業(yè)有限公司;BB5060細胞培養(yǎng)箱，德國Hereus公司。

健康新生SD大鼠，雄性，1 d齡，河北省實驗動物中心中心提供，合格證號:SCXK(冀)2008-1-003。

2 方法

2.1 小鼠成骨細胞的體外培養(yǎng)及鑒定

取新生1 d健康SD大鼠5只，處死，于75%酒精浸泡10 min，置于消毒培養(yǎng)皿中，剪開頭頂皮膚分離顱蓋骨，將顱蓋骨放入D-Hanks液中去除骨膜及周圍結締組織，D-Hanks液沖洗2次，剪成0.1 mm3的骨片塊，浸入0.25%胰蛋白酶，37℃消化30 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加Ⅱ型膠原酶10 mL，37 ℃振蕩消化 2 h，1 000 r/min離心5 min，DMEM培養(yǎng)液沖洗3次，重復離心。加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，調節(jié)細胞密度為1×105，接種于培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后換液，每2 d換液1次，原代細胞至鋪滿瓶底，0.25%胰酶消化，多次貼壁法純化成骨細胞。培養(yǎng)至第3代待用。倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)，NBT-BCIP法定性檢測堿性磷酸酶，鑒定成骨細胞［2-3］。

2.2 對成骨細胞增殖的影響

無血清培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，每孔1×105個細胞的密度接種于5個96孔培養(yǎng)板中，每孔分別加含骨肽濃度為0，75，150，300，600 和1 200 μg/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液至200 μL，每組5個重復孔，同時以正常培養(yǎng)的細胞作對照，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別于第1～6天用MTT法測定成骨細胞的增殖能力。

2.3 對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響［4］

2.3.1 牛血清白蛋白標準曲線 取標準牛血清白蛋白，稀釋成1 g/L，采用梯度稀釋方法，得到25，50，75，100，125，150，175 和 200 mg/L 稀釋液，取1 μL稀釋100倍，加入顯色劑考馬斯亮藍1 mL，在595 nm波長處測定吸光度值，作標準曲線。

2.3.2 酶聯(lián)免疫法檢測骨肽注射液對大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性 取第3代大鼠成骨細胞，按2×104個/孔細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h，細胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化，在各孔內分別加入含25，50，100，200 μg/L骨肽注射液的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3，6，9和12天，用PBS液沖洗3次，胰酶消化，每孔加入3 mL培養(yǎng)基終止消化，混勻離心，棄上清加入磷酸緩沖液5 mL，混勻離心，棄上清控干，加入磷酸緩沖液80 μL混勻后存于-20℃冰箱待檢。以正常培養(yǎng)的細胞作對照，每組5個復孔。檢測之前反復凍融細胞3次，超聲裂解，在酶聯(lián)免疫檢測儀測定405 nm波長處的吸光度值，換算樣本中每1 mg蛋白的堿性磷酸酶活性(nkat/L)。

2.4 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 成骨細胞鑒定

NBT-BCIP法定性檢測堿性磷酸酶，產生藍紫色化合物。

3.2 各組大鼠成骨細胞吸光度比較

與對照組比，骨肽注射液150～1 200μg/L組第6天的細胞增長速度較快(P＜0.05)，并呈現劑量依賴性，骨肽注射液300～1 200 μg/L組對成骨細胞的增殖的促進作用明顯，但600和1 200 μg/L的增長速度與300 μg/L相當，提示骨肽注射液300 μg/L對成骨細胞的增長促進作用最明顯。見表1。

3.3 各組大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性比較

與對照組比，骨肽注射液各個組別對培養(yǎng)3，6，9和12 d的骨細胞堿性磷酸酶活性較高(P＜0.05)，骨肽注射液300～1 200 μg/L組的堿性磷酸酶活性增長速度明顯，但600和1 200 μg/L的增長速度與300 μg/L相當，提示骨肽注射液300 μg/L的成骨細胞堿性磷酸酶活性表達最顯著。見表2。

表1 骨肽注射液對大鼠成骨細胞增殖的影響(±s，n=5)Tab.1 Results of Bone Peptide Injection on neonatal rat osteoblast proliferation(±s，n=5)

表1 骨肽注射液對大鼠成骨細胞增殖的影響(±s，n=5)Tab.1 Results of Bone Peptide Injection on neonatal rat osteoblast proliferation(±s，n=5)

與對照組比較:1P＜0.051P＜0.05 vs control group

組 別 劑量/(μg/L)吸光度值1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d對照組 - 0.571±0.102 0.709±0.069 0.865±0.044 0.921±0.052 1.124±0.075 1.175±0.104骨肽組 75 0.603±0.024 0.721±0.084 0.908±0.055 0.934±0.072 1.152±0.092 1.202±0.091 150 0.674±0.047 0.823±0.096 0.945±0.06111.027±0.07811.184±0.081 1.197±0.095 300 0.762±0.09010.854±0.10510.961±0.07411.181±0.12211.252±0.09711.344±0.1111 600 0.772±0.09910.862±0.11010.972±0.09411.154±0.11611.263±0.10011.301±0.1301 1200 0.755±0.08310.840±0.08710.967±0.07211.134±0.05511.254±0.04411.307±0.212

表2 各組大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性比較(±s，n=5)Tab.2 The results of Bone Peptide Injection on alkaline phosphatase activity(±s，n=5)

表2 各組大鼠成骨細胞堿性磷酸酶活性比較(±s，n=5)Tab.2 The results of Bone Peptide Injection on alkaline phosphatase activity(±s，n=5)

與對照組比較:1P＜0.051P＜0.05 vs control group

組 別 劑量/(μg/L)堿性磷酸酶活性/(nkat/L)3 d 6 d 9 d 12 d對照組 - 0.541±0.042 0.761±0.070 0.941±0.051 1.212±0.073骨肽組 75 0.624±0.0521 0.820±0.104 0.992±0.074 1.301±0.090 150 0.651±0.0421 0.874±0.0541 1.020±0.053 1.344±0.082 300 0.707±0.0621 0.922±0.0701 1.084±0.0821 1.391±0.0401 600 0.715±0.0411 0.935±0.0521 1.073±0.0411 1.380±0.0641 1200 0.711±0.0671 0.911±0.0501 1.081±0.0641 1.392±0.0541

4 討論

成骨細胞是骨形成和骨重建中重要的功能細胞，成骨細胞的增殖、分化受多種因子的調節(jié)［5］。骨肽注射液含有機鈣、磷、無機鈣、無機鹽、微量元素、氨基酸等多種骨代謝的活性肽類代謝因子，通過各種骨生長因子直接作用于成骨細胞，可誘導骨髓細胞轉化為成骨細胞，促進骨髓成骨作用，同時調節(jié)骨代謝，直接調節(jié)骨鈣磷代謝，增加骨鈣磷沉積，刺激成骨細胞增殖促進骨質合成［6-7］。Robinson等［8］體外研究顯示骨肽可促成骨形成，增加骨密度，對人和家兔的骨髓間質細胞具有較強的調節(jié)作用。Chen等［9］研究骨肽可增加成骨細胞特異性中心結合因子-1(cbfa-1)的mRNA表達;目前最新研究顯示骨肽通過激活RhoA/ROCK途徑調節(jié)骨髓基質干細胞向成骨細胞的分化［10］。本課題研究骨肽注射液對大鼠成骨細胞具有明顯的增殖作用，提示骨肽注射液誘導大鼠成骨細胞增殖，增加成骨細胞的數量，促進骨組織生長。

堿性磷酸酶是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，是成骨細胞功能和分化程度的特異性指標，其活性的高低可作為評估成骨細胞成熟的指標。沒有堿性磷酸酶，成骨鈣化不能發(fā)生。本課題結果顯示與對照組比，隨著骨肽注射液濃度的增加，堿性磷酸酶的活性增加明顯，與成骨細胞增殖分化過程與骨形成標志物堿性磷酸酶分泌水平一致的原理吻合，并呈現劑量依賴性關系?？梢姳酒凡粌H促進骨的堿性磷酸酶活躍表達，也可促進成骨細胞進一步分化，與文獻結果一致［10］。

［1］ 李蘭珍.注射用骨肽聯(lián)合紅花注射液治療骨關節(jié)病療效分析［J］.醫(yī)學信息，2010，4(1):64.

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［3］ 劉正偉，高學軍，呂丹娜.低分子牛骨多肽制備及對大鼠成骨細胞的影響［J］.中國生化藥物雜志.2007，32(1):4-8.

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［6］ 阮蓮芝.骨肽注射液的臨床應用［J］.中國臨床藥學雜志，2008，17(5):320-323.

［7］ 施 萊.骨肽注射液在骨科的應用進展［J］.社區(qū)醫(yī)學雜志，2010，8(7):38-39.

［8］ Robinson D，Bab I，Nevo Z.Osteogenic growth peptide regulates proliferation and osteogenic maturation of human and rabbit bone marrow stromal cells［J］.J Bone Miner Res，1995，10(5):690-696.

［9］ Chen Z X，Chang M，Peng Y L，et al.Osteogenic growth peptide C-terminal pentapeptide［OGP(10-14)］acts on rat bone marrow mesenchymal stem cells to promote differentiation to osteoblasts and to inhibit differentiation to adipocytes［J］.Regul Pept，2007，142(1-2):16-23.

［10］徐 楊，陳統(tǒng)一，林飛躍，等.合成成骨生長肽對人骨髓間充質干細胞成骨轉化的促進［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(6):1053-1058.