趙 輝，胡曉晶，柳方娥，程艷娜，焦 波

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東大學(xué) 第二醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250033)

腎臟疾病如IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)、腎小球腎炎等是常見的原發(fā)性腎小球腎炎。20%～40%IgAN患者20～25年后進(jìn)展至終末期腎功能衰竭。IgAN發(fā)病過程中，有多聚IgAl(pIgAl)沉積，IgA沉積于系膜區(qū)將引起腎小球炎癥和損傷，但其后續(xù)的炎癥及小管間質(zhì)改變與其他慢性腎臟疾病的進(jìn)展并無明顯差異。一些生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)等與IgAN的病情進(jìn)展有著十分密切的關(guān)系［1-2］。疾病進(jìn)展過程中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失衡，其合成增多或降解減少導(dǎo)致的ECM蛋白組分過度積聚是腎小球硬化的主要病理特征。目前對IgAN無特異性治療藥物，有報道魚油對IgAN可減輕蛋白尿、改善腎臟損害，其治療作用呈劑量依賴性［3］。

魚油是從深海魚類提取，含豐富的ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA)，其主要活性成分是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。魚油除具有抗血栓、舒血管、調(diào)血脂、抗腫瘤等作用外，還具有一定的腎臟保護(hù)作用，延緩腎臟疾病的進(jìn)展［4-7］，但其機(jī)制目前還不十分清楚。我們前期研究證實EPA和DHA可明顯抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖并促進(jìn)其凋亡［8］，提高 GMC 抗氧化酶活性［9］，對損傷的GMC有一定的保護(hù)作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一組參與 ECM降解的關(guān)鍵酶系，幾乎能降解所有 ECM蛋白組分［10］。金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)是MMP內(nèi)源性抑制劑，可特異性地抑制MMP的表達(dá)與活性［11］。本研究進(jìn)一步觀察 EPA、DHA對 LPS刺激的 GMC表達(dá)MMP、TIMP及 TGF-β1的影響，以研究其腎臟保護(hù)機(jī)制。

1 材料

GMC，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心;胎牛血清(FBS)，杭州四季青公司;RPMI 1640，Solarbio公司;LPS、EPA、DHA，Sigma公司;RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒，TaKaRa公司;引物，上海博尚合成;TGF-β1酶免試劑盒，ADL公司。

2 方法

2.1 MMP-2和MMP-9活性測定

GMC在含0.5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組(LPS 10 mg/L);EPA(10，100 μmol/L，含 LPS 10 mg/L)組、DHA(10，100 μmol/L，含 LPS 10 mg/L)組，無血清培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞上清液，取上清上樣于含0.1%明膠的8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(SDSPAGE);電泳結(jié)束后將膠體置于洗脫液(2.5%Triton X-100)中震蕩洗滌;放入明膠緩沖液(50 mmol/L Tris，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1 μmol/L ZnCl2，pH 7.5)，37 ℃ 孵育18 h;用水漂洗凝膠，置24℃恒溫?fù)u床中考馬斯亮藍(lán)染色4 h，再用水漂洗，將漂洗后的凝膠置于凝膠成像儀下掃描條帶，分析MMP活性。

2.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1 和 TIMP-2 的 mRNA表達(dá)檢測

細(xì)胞培養(yǎng)及分組同2.1項。GMC培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按照試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，并測定總RNA含量。按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL中加RNA 0.5 μg計算，取 RNA 0.5 μg 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照，用實時定量PCR方法進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。MMP-2上游引物5'-TTTGTTTGCCCTTTGCTGTTTG-3'，下游引物 5'-AGCCGATGACTTGGTTCTCC-3'，產(chǎn)物 198 bp;MMP-9 上游引物5'-CCTACTGCTGGTCCTTCTGAG-3'，下游引物5'-TTGGCTTCCTCCGTGATTCG-3'，產(chǎn)物 159 bp;TIMP-1上游引物5'-TCCTGGTTCCCTGGCATAATC-3'，下游引物 5'-CAAGCAATGACTGTCACTCTCC-3'，產(chǎn)物137 bp;TIMP-2上游引物5'-TGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC-3'， 下 游 引 物 5'-TGCTGAAGAGGGGGCCGTGTAGAT-3'，產(chǎn)物 210 bp;GAPDH上游引物5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，下游引物5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'，產(chǎn)物308 bp。各種引物使用前均稀釋為10 μmol/L。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)，反應(yīng)在ABI Prism 7000 sequence detector(ABI公司)中進(jìn)行。采用實時熒光定量PCR相對定量分析方法(2-△△Ct法)進(jìn)行分析:△△Ct=［Ct(實驗組基因)-CtGAPDH(實驗組基因)］-［Ct(對照組基因)-CtGAPDH(對照組基因)］，2-△△Ct表示實驗各處理組目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

2.3 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量

分組同2.1項。各組分別培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞上清液，參考試劑盒說明書檢測 TGF-β1含量。結(jié)束反應(yīng)后，于450 nm波長處檢測定吸光度值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 EPA、DHA對LPS刺激的大鼠腎小球系膜細(xì)胞MMP-2、MMP-9活性的影響

見圖1。由圖1可知，用LPS刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)液中MMPs活性有所降低，EPA和DHA可以提高M(jìn)MP活性(P＜0.05)。

3.2 EPA、DHA對LPS刺激的GMC MMP和TIMP mRNA表達(dá)的影響

LPS刺激GMC后，細(xì)胞表達(dá)MMP mRNA明顯降低，TIMPmRNA明顯增高，MMP-2/TIMP-2以及MMP-9/TIMP-1比值明顯降低。經(jīng)EPA和DHA作用后，MMP、TIMP mRNA表達(dá)呈現(xiàn)一定抑制作用，但MMP-2/TIMP-2以及 MMP-9/TIMP-1比值明顯升高。見表1～2。

圖1 EPA、DHA對LPS誘導(dǎo)的GMC MMP-2和MMP-9活性的影響Fig.1 Effects of EPA and DHA on the activity of MMP-2，9 in GMC induced by lipopolysaccharide

3.3 EPA、DHA對 LPS刺激GMC產(chǎn)生 TGF-β1蛋白含量的影響

LPS刺激GMC后，細(xì)胞分泌TGF-β1含量顯著升高，加入EPA、DHA后，上清液中TGF-β1含量顯著降低。見表3。

4 討論

GMC是腎小球固有細(xì)胞中功能最活躍的細(xì)胞［12］。生理狀態(tài)下，GMC行使收縮、吞噬及維持ECM代謝平衡等各種功能。病理狀態(tài)下，各種刺激因素誘導(dǎo)的GMC增殖及ECM積聚，是腎小球疾病進(jìn)展的基本病理過程。腎小球ECM主要蛋白組分包括Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等。ECM合成增多或降解減少導(dǎo)致的ECM過度積聚，是各種腎病發(fā)展至腎小球硬化的共同病理表現(xiàn)。許多蛋白酶可以降解ECM蛋白組分，而MMP是一組最重要的ECM降解酶系［13］。TIMP是MMP的內(nèi)源性特異性抑制劑，通過與MMP催化活性中心的Zn2+結(jié)合而封閉其催化活性，抑制其對特異性ECM蛋白的降解。腎組織主要表達(dá)MMP-2、MMP-9及其特異性抑制劑TIMP-2、TIMP-1，參與調(diào)節(jié)生理及病理狀態(tài)下ECM代謝平衡。當(dāng)經(jīng)典炎癥刺激物L(fēng)PS刺激GMC后，GMC 出現(xiàn)異常增殖［8，14］，合成 ECM 蛋白組分增加。MMP、TIMP作為調(diào)控ECM代謝的關(guān)鍵酶系，其表達(dá)可能存在紊亂，酶活性降低。

表1 EPA、DHA對LPS刺激GMC MMP-2/TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.1 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-2/TIMP-2 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表1 EPA、DHA對LPS刺激GMC MMP-2/TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.1 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-2/TIMP-2 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

與LPS組比較:1P＜0.05，2P＜0.01Compared with LPS group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組 別 濃度/(μmol/L)MMP-2 TIMP-2 MMP-2/TIMP-2 LPS組-0.71±0.08 1.68±0.04 0.43±0.06 EPA組 10 0.66±0.03 1.10±0.162 0.60±0.101 100 0.51±0.041 0.66±0.032 0.78±0.043 DHA組 10 0.69±0.04 0.87±0.112 0.80±0.141 100 0.52±0.041 0.67±0.062 0.78±0.082

表2 EPA、DHA對LPS刺激GMC MMP-9/TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表2 EPA、DHA對LPS刺激GMC MMP-9/TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of EPA and DHA on the mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 in GMC stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

與LPS組比較:1P＜0.05，2P＜0.01Compared with LPS group:1P ＜0.05，2P ＜0.01

組 別 濃度/(μmol/L)MMP-9 TIMP-1 MMP-9/TIMP-1 LPS組-0.74±0.06 1.78±0.05 0.42±0.05 EPA組 10 0.62±0.05 0.92±0.032 0.67±0.072 100 0.46±0.062 0.64±0.062 0.73±0.161 DHA組 10 0.56±0.09 0.74±0.042 0.77±0.131 100 0.50±0.071 0.61±0.062 0.82±0.042

表3 EPA、DHA對LPS刺激GMC產(chǎn)生TGF-β1蛋白含量的影響(±s，n=3)Tab.3 Effects of EPA and DHA on lipopolysaccharide stimulated TGF-β1 in GMC(±s，n=3)

表3 EPA、DHA對LPS刺激GMC產(chǎn)生TGF-β1蛋白含量的影響(±s，n=3)Tab.3 Effects of EPA and DHA on lipopolysaccharide stimulated TGF-β1 in GMC(±s，n=3)

與對照組比較:1P＜0.01;與LPS組比較:2P＜0.01Compared with control group:1P＜0.01;Compared with LPS group:2P＜0.01

組 別 濃度/(μmol/L) TGF-β1/(ng/mL)對照組-1.31±0.12 LPS組 - 1.93±0.101 EPA組 10 1.75±0.05 100 1.44±0.032 DHA組 10 1.78±0.09 100 1.38±0.102

LPS可致細(xì)胞MMP酶活性變化［15-16］，本研究結(jié)果顯示，經(jīng) LPS刺激后，GMC表達(dá) MMP-2、MMP-9 mRNA降低，但 TIMP-1、TIMP-2 mRNA增高，由于TIMP對MMP活性的抑制作用，造成MMP活性降低，在整體的表現(xiàn)即為ECM過度積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化。同時，在腎臟的損傷中，TGF-β1是個重要的細(xì)胞因子，其表達(dá)的增加可以進(jìn)一步引起腎臟的損傷。本實驗給予 EPA、DHA干預(yù)，通過對MMP、TIMP表達(dá)的影響，使MMP/TIMP比值提高，MMP活性增加，MMP/TIMP代謝失衡得以改善，同時TGF-β1的產(chǎn)生也顯著降低，這可能是魚油保護(hù)腎臟、延緩腎臟疾病進(jìn)展的機(jī)制之一。

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