任嫦娥，郭惠萍

(山西省交口縣人民醫(yī)院 1.藥劑科，2.消化內科，山西 交口 032400)

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率高，居我國癌癥的第二位。我國每年因肝癌而死亡的人數20余萬，約占世界肝癌死亡人數的45%［1］。肝癌已經成為嚴重危害人類健康的惡性疾病。大多數肝癌患者發(fā)現時已進入晚期而失去手術時機，化學治療對肝癌患者尤其是晚期患者仍占重要的地位。但化療藥物不良反應嚴重、易發(fā)生耐藥，而影響肝癌的治療［2］。研究和尋找對肝癌療效高、不良反應輕的藥物是迫切需要解決的問題之一。

姜黃素(curcumin)為姜黃(Curcuma longa)的重要活性成分之一，是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，具有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、清除自由基及抑制腫瘤生長等作用［3］，且抗癌譜廣，可抑制多種體外建株腫瘤細胞的生長［4-6］。目前，姜黃素對肝癌細胞 HepG2和Bel-7404增殖的影響未見報道。本研究以姜黃素干預肝癌HepG2和Bel-7404細胞，探討姜黃素的抗腫瘤活性，旨在為姜黃素治療肝癌提供實驗依據。

1 材料

姜黃素(含量＞80%)，美國Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司，新生牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司;順鉑，山東羅欣藥業(yè)股份有限公司。

人肝癌細胞株HepG2和Bel-7404，上海細胞資源中心。

SHEL-LAB2300 CO2培養(yǎng)箱，日本三洋工業(yè)株式會社;Bio-RAD550全自動酶標儀，美國伯樂公司;Olympus倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2和Bel-7404分別接種于含10%FBS和含1%鏈霉素、青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)下孵育，以0.25%胰蛋白酶消化，細胞呈單層貼壁生長，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 分組

空白對照組為含0.2%DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)基和細胞;順鉑組為含0.2%DMSO的 RPMI 1640培養(yǎng)基和細胞以及2.5 μg/mL順鉑;姜黃素組共設 5 個濃度組(2.5，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/mL)，每孔加入相應濃度的姜黃素和含0.2%DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)基以及細胞加不同濃度的姜黃素。作用時間均為12，24，48和72 h。

2.3 細胞增殖的檢測

采用MTT法檢測細胞增殖，將含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至一定濃度后，取對數生長期肝癌細胞HepG2和Bel-7404，分別以3×103/mL的活細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，體積為200 μL/孔，37℃、5%CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)下孵育，待細胞貼壁生長后加入不同濃度姜黃素及順鉑溶液，加藥量為200 μL/孔，不同加藥量設6個平行孔。孵育12，24，48和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻后，用酶標儀測定每孔在490 nm波長處的吸光度(A)值，根據A值判定藥物對細胞增殖的影響，并計算細胞生長抑制率(IR)［7］。IR=(1-A實驗組/A對照組)×100%。實驗重復3次，取平均值。

2.4 統計學方法

數據分析采用SPSS13.0統計分析軟件，計量資料采用(±s)表示，計量資料比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 姜黃素作用不同時間后對肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用

結果表見1。姜黃素對肝癌細胞HepG2的增殖抑制有量效關系，并呈時間依賴性。在相同作用時間下，與空白對照組比較，2.5，10.0 μg/mL姜黃素對肝癌細胞HepG2的增殖沒有明顯的抑制作用(P＞0.05)，而 25.0，50.0，100.0 μg/mL 姜黃素以及順鉑組對肝癌細胞HepG2的增殖均有明顯的抑制作用(P＜0.05)。

3.2 姜黃素作用不同時間后對肝癌細胞Bel-7404的增殖抑制作用

結果見表2。姜黃素對肝癌細胞Bel-7404的增殖抑制有量效關系，并呈時間依賴性。在相同作用時間下，與空白對照組比較，2.5，10.0 μg/mL姜黃素對肝癌細胞Bel-7404的增殖沒有明顯的抑制作用(P ＞0.05)，而 25.0，50.0，100.0 μg/mL 姜黃素以及順鉑組對肝癌細胞Bel-7404的增殖均有明顯的抑制作用(P＜0.05)。

4 討論

姜黃素來源豐富，廣泛存在于姜科植物姜黃、莪術、郁金以及天南星科植物菖蒲的根莖中。目前姜黃素抗腫瘤活性是國內外研究的熱點，其抗腫瘤機制較為復雜，在不同的細胞類型中表現出不同的效應，誘導效應產生的分子機制也不盡相同。目前國內外研究普遍認為姜黃素的抗腫瘤作用機制可能主要與抑制腫瘤細胞的生長和增殖、誘導腫瘤細胞凋亡有關［8］，而且是通過抑制核轉錄因子的活性、調控癌基因、抑癌基因蛋白和凋亡調控蛋白的表達等途徑抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導腫瘤細胞凋亡［9-10］。姜黃素對大腸癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的化學防護作用已得到部分證實［11-12］。

本研究以不同濃度的姜黃素分別作用肝癌HepG2和Bel-7404細胞，采用MTT法檢測姜黃素對肝癌HepG2和Bel-7404細胞增殖抑制作用，結果顯示，不同濃度的姜黃素組、順鉑組的A值與空白對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。不同濃度的姜黃素和順鉑作用于肝癌HepG2和Bel-7404細胞后，細胞的增殖受到明顯的抑制，并呈劑量-時間關系。特別是25.0，50.0和100.0 μg/mL姜黃素在不同的作用時間對肝癌HepG2和Bel-7404細胞的增殖均有明顯的抑制作用(P＜0.05)。表明姜黃素對肝癌HepG2和Bel-7404細胞有較強的體外細胞毒性作用，可以明顯的抑制肝癌HepG2和Bel-7404細胞增殖的生長，且存在劑量-時間的關系。姜黃素對肝癌HepG2和Bel-7404細胞增殖的抑制作用為姜黃素抗腫瘤的研究提供了一定的參考。

表1 姜黃素作用不同時間后對肝癌細胞HepG2的影響(±s，n=3)Tab.1 The effect of curcumin on human HepG2 cells at different incubation time(±s，n=3)

表1 姜黃素作用不同時間后對肝癌細胞HepG2的影響(±s，n=3)Tab.1 The effect of curcumin on human HepG2 cells at different incubation time(±s，n=3)

與空白對照組比較:1P＜0.05Compared with the control group:1P＜0.05

組 別 劑量/(μg/mL) 抑制率/%12 h 24 h 48 h 72 h空白對照組-0000姜黃素組 2.5 5.67±1.89 4.43±1.48 2.86±0.95 3.70±1.23 10.0 12.35±4.12 13.72±4.57 14.81±4.94 20.72±6.91 25.0 18.19±6.061 24.15±8.051 29.88±9.961 40.89±13.631 50.0 32.50±10.831 40.83±13.611 49.00±16.331 62.00±20.671 100.0 45.61±15.201 57.37±19.121 69.03±23.011 83.31±27.771順鉑組 2.5 49.67±16.561 65.03±21.681 80.32±26.771 93.85±31.281

表2 姜黃素作用不同時間后對肝癌細胞Bel-7404的影響(±s，n=3)Tab.2 The effect of curcumin on human Bel-7404 cells at different incubation time(±s，n=3)

表2 姜黃素作用不同時間后對肝癌細胞Bel-7404的影響(±s，n=3)Tab.2 The effect of curcumin on human Bel-7404 cells at different incubation time(±s，n=3)

與空白對照組比較:1P＜0.05Compared with the control group:1P＜0.05

組 別 劑量/(μg/mL) 抑制率/%12 h 24 h 48 h 72 h空白對照組-0000姜黃素組 2.5 9.02±3.01 11.98±3.99 8.58±2.86 6.82±2.27 10.0 20.24±6.75 20.66±6.89 17.69±5.90 9.69±3.23 25.0 48.90±16.301 40.12±13.371 31.37±10.461 20.47±6.821 50.0 73.55±24.521 61.08±20.361 52.28±17.431 40.93±13.641 100.0 85.97±28.661 77.84±25.951 69.44±23.151 59.07±19.691順鉑組 2.5 80.96±26.991 74.25±24.751 64.61±21.541 57.99±19.331

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