謝 琦，李 娟，王鳳山

(1.桂林醫(yī)學(xué)院 生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004;2.山東大學(xué) 藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟(jì)南 250012)

胸腺五肽(TP5)是一種免疫調(diào)節(jié)活性較強(qiáng)的多肽藥物，但它較短的半衰期(30 s)影響了其療效的發(fā)揮［1］。胸腺素 α1(Tα1)具有與 TP5相似的生物活性與臨床用途，其血漿半衰期(t1/2)長(zhǎng)達(dá)1.5 h［2］。為了快速、大量獲得在活性和穩(wěn)定性方面都優(yōu)于TP5和Tα1的多肽藥物，我們構(gòu)建了與GST基因融合表達(dá)的胸腺融合肽Tα1-TP5表達(dá)菌株，在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)［3］。

IPTG作為乳糖類似物，是一種高效的重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑，但它對(duì)人體具有潛在的毒性［4］，而且價(jià)格昂貴，使其在基因工程藥物大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。乳糖是一種有潛力的可以替代IPTG的誘導(dǎo)劑，乳糖進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)過β-半乳糖苷酶的作用轉(zhuǎn)化為異乳糖，進(jìn)而起到誘導(dǎo)劑的作用［5-6］。乳糖沒有毒性且價(jià)格低廉，用乳糖替代IPTG已成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究以乳糖作為誘導(dǎo)劑，在搖瓶發(fā)酵條件下研究了不同培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)方式對(duì)目的肽Tα1-TP5表達(dá)的影響，旨在為實(shí)現(xiàn)Tα1-TP5低成本、高產(chǎn)量的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

含pGEX-4T-1/Tα1-TP5重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)，由山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

酵母粉、蛋白胨、丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)，BBI公司;IPTG，Merck公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，121℃滅菌20 min;TB培養(yǎng)基:酵母粉2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，磷酸二氫鉀17 mmol/L，磷酸氫二鉀72 mmol/L，高壓滅菌時(shí)磷酸鹽與其它組分分開，待溶液冷卻至60℃以下后混合。

2.2 工程菌培養(yǎng)

原始凍干菌種室溫自然解凍后，接種于新鮮的含50 g/mL氨芐西林(Amp)的固體LB或TB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，再挑單菌落轉(zhuǎn)接于新鮮的液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)。

2.3 菌體生長(zhǎng)及目的蛋白表達(dá)量的測(cè)定

菌體生長(zhǎng)量以A600值表示。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，取菌液1 mL，離心收集菌體，加入1×上樣緩沖液200 μL 混勻，100 ℃加熱 5 min，12 000 r/min 離心2 min，取上清 10 μL，行 12%SDS-PAGE 電泳，AlphaEase凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析各樣品所含目的蛋白的比例。

2.4 GST-Tα1-TP5融合蛋白可溶性表達(dá)的測(cè)定

誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，取菌液1 mL，離心收集菌體，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，超聲破菌后，12 000 r/min離心10 min，分別取上清及沉淀，行12%SDS-PAGE電泳。

2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

按2.2項(xiàng)下方法，將工程菌分別接種于含Amp的LB及TB培養(yǎng)基中，在誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、乳糖濃度相同的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

2.6 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)2.5項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TB培養(yǎng)基更有利于目的蛋白的表達(dá)，以下實(shí)驗(yàn)均使用TB培養(yǎng)基。

按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行工程菌培養(yǎng)，分別以0.5%的接種量，轉(zhuǎn)接于裝有TB培養(yǎng)基100 mL的錐形瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)，在菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前、中、后期，即菌液 A600值分別為 0.5，0.9，1.4 時(shí)加入乳糖，使其終濃度為2 g/L，在誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、乳糖濃度相同的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

2.7 誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行工程菌培養(yǎng)，在誘導(dǎo)時(shí)間、乳糖濃度、轉(zhuǎn)速等條件相同的情況下，置不同溫度(25，30，37℃)的搖床中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量，檢測(cè)最佳誘導(dǎo)溫度下目的蛋白的可溶性表達(dá)情況。

2.8 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

按2.2方法進(jìn)行工程菌培養(yǎng)，至最佳誘導(dǎo)A600值，分別加入不同濃度的乳糖誘導(dǎo)劑，使其終濃度為0.5，1，2，3，5 g/L，在最佳誘導(dǎo)溫度下培養(yǎng) 6 h，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

2.9 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行工程菌培養(yǎng)，至最佳誘導(dǎo)A600值，在最佳誘導(dǎo)濃度下誘導(dǎo)表達(dá)。從誘導(dǎo)開始起每1 h取菌液1次，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

2.10 誘導(dǎo)方式對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行工程菌培養(yǎng)，至最佳誘導(dǎo)A600值，分別按一次性或分批的方式加入誘導(dǎo)劑。一次性的方式為一次性添加最佳誘導(dǎo)濃度的量;分批的方式為自誘導(dǎo)始，每隔1 h添加一次乳糖，添加量為最佳量的1/4，共添加4次。兩種方式的誘導(dǎo)時(shí)間均為6 h。檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

2.11 乳糖誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)效果的比較

按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的乳糖誘導(dǎo)的最佳條件進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，與相同條件下，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)判乳糖誘導(dǎo)的效果。

3 結(jié)果

3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

在其它誘導(dǎo)條件相同的情況下，工程菌在TB培養(yǎng)基中目的蛋白的表達(dá)量較高。SDS-PAGE電泳后經(jīng)AlphaEase軟件分析，TB培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基中目的蛋白的表達(dá)量高，為總蛋白的32.5%。結(jié)果見圖1。

圖1 目的蛋白在不同培養(yǎng)基中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of target protein in different culture media

3.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果表明，在發(fā)酵時(shí)間相同的條件下，在菌體生長(zhǎng)期的各個(gè)階段加入乳糖均有目的蛋白的表達(dá)。比較而言，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期(A600約為1.4)進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量最高，但只是略高于中期(A600約為0.9)，明顯高于前期。說明在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的早期誘導(dǎo)不利于目的蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期一個(gè)較寬的時(shí)間范圍內(nèi)誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量變化不大，這個(gè)特性有利于大規(guī)模重組產(chǎn)物的生產(chǎn)控制。結(jié)果見圖2。

圖2 不同時(shí)期誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的情況Fig.2 Expression of target protein in different induction time

3.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

在其它誘導(dǎo)條件相同的情況下，37℃時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高(圖3)。通過測(cè)定在37℃時(shí)目的蛋白的表達(dá)形式，可知主要以可溶的方式表達(dá)(圖 4)。

3.4 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，終濃度為0.5 g/L的乳糖即可誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，當(dāng)乳糖濃度達(dá)到1 g/L時(shí)可獲得35%的目的蛋白的表達(dá)量。說明工程菌對(duì)乳糖的誘導(dǎo)效應(yīng)是十分敏感的，較低濃度的乳糖即能啟動(dòng)目的基因的高效表達(dá)。乳糖濃度達(dá)到1 g/L后，目的蛋白的表達(dá)量不再隨乳糖濃度的增加而增加。所以對(duì)此工程菌而言，乳糖的最佳誘導(dǎo)濃度是1g/L。見圖5。

3.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，加入乳糖后，目的蛋白的表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，至6 h達(dá)到最高，之后不再隨時(shí)間的增加而增加。故乳糖的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。見圖6。

圖3 目的蛋白在不同誘導(dǎo)溫度下的表達(dá)情況Fig.3 Expression of target protein at different induction temperatures

圖4 目的蛋白的表達(dá)形式Fig.4 Expression form of target protein

圖5 不同濃度乳糖的誘導(dǎo)結(jié)果Fig.5 The target protein expression induced by lactose at different concentrations

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of induction time on the expression of target protein

3.6 誘導(dǎo)方式對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，一次性添加乳糖誘導(dǎo)的方式與流加乳糖誘導(dǎo)的方式對(duì)目的蛋白的表達(dá)量的影響無明顯差異，見圖7。從有利于操作的角度出發(fā)，一次性添加的方式更簡(jiǎn)便。

圖7 誘導(dǎo)方式對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of induction modalities on the expression of target protein

3.7 乳糖誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)效果的比較

結(jié)果顯示，在乳糖誘導(dǎo)的最佳條件下目的蛋白的表達(dá)可達(dá)到IPTG的誘導(dǎo)效果，見圖8。

圖8 不同誘導(dǎo)劑對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of different inducers on the expression of target protein

4 討論

含有乳糖操縱子的表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。IPTG是乳糖操縱子高效的誘導(dǎo)劑，其在大腸桿菌中不被降解和代謝，誘導(dǎo)條件簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)濃度低，誘導(dǎo)效果持久。但由于它對(duì)人體潛在的毒性，當(dāng)利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)應(yīng)用于人體的基因工程藥物時(shí)，有可能對(duì)產(chǎn)品帶來一些不利的影響，而且IPTG的價(jià)格昂貴，在大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用必然會(huì)造成發(fā)酵成本的增加，所以通常只作為實(shí)驗(yàn)室表達(dá)少量蛋白質(zhì)時(shí)的誘導(dǎo)劑。乳糖作為原核細(xì)胞的常用碳源，對(duì)乳糖操縱子具有天然的誘導(dǎo)作用，但由于乳糖可以被菌體代謝利用，同時(shí)，作為一種糖類物質(zhì)，它的存在必然會(huì)引起細(xì)胞在轉(zhuǎn)運(yùn)以及生理代謝等方面的一系列復(fù)雜變化。與IPTG相比，利用乳糖為誘導(dǎo)劑其誘導(dǎo)過程更復(fù)雜，誘導(dǎo)條件需要更深入地研究和優(yōu)化。盡管如此，乳糖以其無毒、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，使其在重組基因工程藥物的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中具有優(yōu)于IPTG的潛在價(jià)值和優(yōu)勢(shì)。

本文以乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑，對(duì)影響菌體生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)基組成、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)方式等因素進(jìn)行了深入的研究，從中分析并尋找適合工程菌生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)的條件。結(jié)果表明，TB培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基更有利于工程菌的生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的表達(dá)，這主要是因?yàn)門B培養(yǎng)基比大腸桿菌常用的LB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)更豐富，此外TB培養(yǎng)基中的甘油作為碳源，使得菌體生長(zhǎng)過程中不會(huì)產(chǎn)生乙酸，利于重組蛋白的積累，而磷酸鹽中的鉀離子能夠維持細(xì)胞滲透壓，磷酸根能保持菌體生長(zhǎng)過程中穩(wěn)定的pH。乳糖終濃度為1 g/L時(shí)即可誘導(dǎo)目的蛋白的高效表達(dá)，成本不足IPTG誘導(dǎo)的15%。在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期誘導(dǎo)有利，推測(cè)是因?yàn)槿樘寝D(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^程，需要一系列酶的參與，因而需要一定的生物量和透過酶的表達(dá)作為目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)，所以在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期誘導(dǎo)更有利于目的蛋白的表達(dá)。此外，最佳誘導(dǎo)溫度為37℃，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，分批流加乳糖4次和一次性加入乳糖誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)量無明顯差異。在優(yōu)化后的條件下，乳糖誘導(dǎo)的GST-Tα1-TP5融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的35%，且主要以可溶形式表達(dá)，與IPTG的誘導(dǎo)效果無明顯差異。在隨后的研究中，乳糖將作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于高密度發(fā)酵過程。這些研究結(jié)果不僅為實(shí)現(xiàn)胸腺融合肽Tα1-TP5的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，而且也可為其它由乳糖操縱子調(diào)控的重組基因工程藥物的工業(yè)化生產(chǎn)提供有益的參考和借鑒。

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