蘇 瑞，強萌萌，王 楠，羅學剛，姜 勇，肖珊珊，成彩蓮，張同存，，3

(1.天津科技大學 生物工程學院 工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津 300457;2.武漢科技大學 醫(yī)學院，湖北 武漢 430065;3.天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457)

主動脈血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)是一種多功能間葉細胞，它是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細胞成分［1］，在胚胎和成人的動脈壁損傷以及動脈粥樣硬化等病變中均可見到平滑肌細胞分化與增殖的表型轉(zhuǎn)變［2］。已有研究表明，平滑肌細胞處于分化型可抑制動脈粥樣硬化發(fā)生，而處于增殖型則是導致動脈粥樣硬化發(fā)展的關(guān)鍵因素。

雌激素是一種女性激素，人體內(nèi)雌激素主要有雌二醇、雌酮及其代謝產(chǎn)物雌三醇，其中雌二醇生理作用最強，而雌三醇僅有部分作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，雌激素對于VSMCs表型轉(zhuǎn)化具有調(diào)控作用［3］，他莫昔芬、雷洛昔芬等抗雌激素藥物則顯示出具有減輕脂質(zhì)致動脈粥樣硬化的作用［4］。

SM22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)蛋白是Miller等［5-6］在1987年首次從雞的胃平滑肌中分離而來的，因其相對分子質(zhì)量為22 000而得名。SM22α是平滑肌最重要的的分化標記基因，其表達水平的高低是判定平滑肌處于分化型還是增殖型的重要標志。

為確定雌激素信號通路對VSMCs中SM22α轉(zhuǎn)錄表達水平的調(diào)節(jié)作用，本研究構(gòu)建了SM22α啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒(SM22α-luc)，并利用熒光素酶報告分析方法，對17-β雌二醇(E2)、雌激素受體 α(Estrogen Receptor α，ERα)以及平滑肌重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Myocardin在SM22α轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中的作用進行了初步研究。

1 材料

Myocardin、ERα真核表達質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、COS-7非洲綠猴胚腎細胞系均為天津科技大學分子藥理實驗室保存;實驗所需大鼠基因組天津科技大學分子藥理實驗室提供。

Fastpfu酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD購自羅氏公司;E2購自Sigma公司，雙熒光報告系統(tǒng)試劑盒購自Promega。

雌性SD大鼠，體質(zhì)量60～70 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號:0036909。

2 方法

2.1 大鼠基因組DNA的提取

切取大鼠的肝臟組織塊置于冰上，剔除結(jié)締組織，剪碎放入研缽(越細越好)，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)吹懸，將洗滌后的肝臟細胞加裂解液500 μL和蛋白酶 K(終濃度100 mg/mL)，輕柔搖勻，然后將其置于50℃水浴中孵育3 h。將溶液冷卻至室溫，加入Tris-HCl(pH 8.0)平衡過的苯酚，溫和混勻兩相，室溫離心，然后轉(zhuǎn)移上層水相至離心管中，用氯仿抽提兩次，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加NaCl(終濃度0.2 mol/L)和等體積的異丙醇，溫和搖勻，離心棄上清，加入75%乙醇使沉淀懸浮，離心棄去乙醇。加入超純水30 μL溶解基因組DNA，-20℃保存待用。

2.2 SM22α啟動子的擴增

根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫檢索獲得的大鼠SM22α啟動子序列，選擇包含雌激素反應元件(Estrogen Response Elements，EREs，GGTCAnnnTGACC)和 Myocardin轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件CArG box(CCW6GG，W為A或T)的-1100-+77序列，設計引物。其中 SM22αluc上游引物序列:5'-GCGAGCTCGTGAGTGTGTGAGACATAGCAC-3'，下游序列:5'-GCAAGCTTGGCTTGGTCGTTTGTGGACTG-3'。在引物中分別引入SacⅠ和HindⅢ酶切位點(如下劃線所示)。

以大鼠基因組為模版，利用FastPfu聚合酶進行PCR反應。反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，擴增30個循環(huán)。反應結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2.3 SM22α-luc質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR反應結(jié)束后，分別將PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic質(zhì)粒(圖1)用SacⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶于37℃酶切16 h，然后利用T4 DNA連接酶于16℃連接16 h。取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有0.1%氨芐西林(Amp)的固體LB瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。隨機挑選轉(zhuǎn)化單菌落，接種于含0.1%Amp的液體LB培養(yǎng)基5 mL中，37℃振蕩(200 r/mim)培養(yǎng)過夜。參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒的小量制備，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。菌液送上海Invitrogen公司進行測序驗證。

圖1 pGL3-basic載體圖譜Fig.1 pGL3-Basic Vector circle map.

2.4 細胞培養(yǎng)

COS-7及VSMCs均采用含10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃，95%O2和5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。其中，VSMCs為取自于大鼠的原代細胞，具體操作如下:大鼠以頸椎脫臼法處死，迅速在無菌條件下開胸，暴露胸主動脈，小心剃除筋膜和附著的脂肪，取出約2 cm長胸主動脈，放入PBS洗凈，在無菌工作臺上小心剝?nèi)ネ饽ず徒Y(jié)締組織，破壞內(nèi)膜，用PBS沖洗干凈后，把血管中膜剪成約1 mm3碎片，用尖嘴吸管將組織塊放入培養(yǎng)瓶，均勻鋪開使組織塊規(guī)則排列，待組織塊固定后加入含10%血清的DMEM，倒置培養(yǎng)瓶，在37℃，95%O2和5%CO2條件下培養(yǎng)。約1周后細胞長滿瓶底，加入PBS沖洗后倒掉液體，用胰酶消化2～3 min后倒掉液體，再加入兩倍量的含10%血清的DMEM，平分所得液體到原培養(yǎng)瓶和另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)傳代4～6次后用于實驗。

2.5 轉(zhuǎn)染

采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD對COS-7細胞系和VSMCs進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h，以1×105個/孔的細胞密度接種到24孔板中，轉(zhuǎn)染步驟參照說明書進行，轉(zhuǎn)染6 h后可換為正常培養(yǎng)液。

2.6 熒光素酶活性檢測

細胞轉(zhuǎn)染24 h后，吸去培養(yǎng)液，用冰預冷的PBS洗滌細胞。利用蛋白裂解液裂解細胞，按照Promega雙熒光報告系統(tǒng)試劑盒說明書進行操作，利用熒光化學發(fā)光系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

3 結(jié)果

3.1 SM22α-luc質(zhì)粒的構(gòu)建和測序

提取以大鼠基因組作為模板，利用設計好的引物進行PCR擴增，如圖2所示，1%瓊脂糖凝膠電泳后可檢測到約1.1 kb的目的條帶。

將PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切后與pGL3-Basic載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。把所提取的質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖3所示，可檢測到清晰的兩條帶，其中4 818 bp處為pGL3-Basic載體，1 063 bp處為SM22α啟動子。進一步的測序分析結(jié)果顯示，目標序列與源序列匹配率100%，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖4)。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測啟動子的擴增Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of promoter amplification

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切產(chǎn)物Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of double digestion

圖4 測序比對結(jié)果Fig.4 Result of DNA sequence alignment

3.2 細胞的培養(yǎng)和傳代

為考察E2對VSMCs中SM22α轉(zhuǎn)錄活性的影響，首先對大鼠VSMCs原代細胞進行了分離培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。由組織塊周圍游離出的VSMCs成典型的峰谷樣、放射狀生長，細胞形態(tài)多呈寬大的長梭形(圖5A)。經(jīng)過傳代后，VSMCs生長速度加快，折光性加強，呈明顯的長梭型(圖5B)。

此外，還對凍存COS-7細胞進行了復蘇培養(yǎng)，經(jīng)過1～2次傳代后，細胞生長速度明顯加快，折光性好，胞體成不規(guī)則的長梭型(圖6)。

圖5 VSMCs的分離和培養(yǎng)(100×)Fig.5 Isolation and cultivation of VSMCs(100×)

圖6 COS-7細胞的培養(yǎng)(100×)Fig.6 Cultured COS-7(100×)

3.3 E2/ERα信號通路對SM22α啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

為確定E2/ERα信號通路對SM22α啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用，首先考察了 E2在 VSMCs中對SM22α-luc質(zhì)粒熒光素酶活性的影響。用生理濃度的E2(10-8mol/L)處理VSMCs，結(jié)果表明，加入生理濃度E2組的SM22α-luc熒光素酶活性顯著低于空白對照組(P＜0.05)，提示在有內(nèi)源性ERα表達的VSMCs中，E2可以抑制SM22α在VSMCs中的轉(zhuǎn)錄活性。

在此基礎上，為進一步揭示E2/ERα信號通路抑制SM22α啟動子轉(zhuǎn)錄活性的潛在機制，進一步在COS-7細胞中對VSMCs分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Myocardin在這一過程中的作用進行了分析。結(jié)果如圖7所示，Myocardin可明顯增強SM22α-luc的活性，但當與ERα共同轉(zhuǎn)染后，其活性則顯著降低。同時，在E2存在情況下，ERα的這種抑制能力進一步顯著增強。表明 E2/ERα信號通路可能通過拮抗Myocardin對SM22α啟動子的轉(zhuǎn)錄激活功能，從而發(fā)揮抑制SM22α轉(zhuǎn)錄活性的作用。

圖7 COS-7細胞中有或無E2時ERα、Myocardin對SM22-luc的影響Fig.7 ERα and Myocardin influence on the SM22-luc with E2 or not in COS-7

4 討論

ERα是核受體超家族的成員，雌激素使其二聚化，并直接與雌激素反應基因上EREs結(jié)合或通過與其他的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白相互作用，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，已有研究表明，雌激素及其受體(ERα)可以調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖［7-8］。

Myocardin是一種特異性調(diào)節(jié)心肌和血管平滑肌細胞分化基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過與血清反應因子(SRF)形成復合物結(jié)合到靶基因啟動子上的CArG box(CCW6GG，W為A或T)位點來調(diào)節(jié)下游基因轉(zhuǎn)錄，在誘導心肌肥厚以及抑制血管平滑肌細胞增殖方面具有重要作用［9-10］，在心血管中的表達以及對血管保護方面具有良性作用［11］。

早期的回顧性研究表明，雌激素對絕經(jīng)后女性的心血管有保護作用，因此催生了對絕經(jīng)后女性的雌激素替代療法。然而最近美國WHI(Women's Health Initiative)等多家機構(gòu)的臨床研究卻均未能證明這一點，甚至提示弊大于利，這些多中心臨床實驗結(jié)果表明雌激素替代療法會增加早期的心血管疾病的患病危險［12］。此外，他莫昔芬、雷洛昔芬等選擇性ERα拮抗劑，則可以通過競爭性抑制ERα轉(zhuǎn)錄活性，并在動脈粥樣硬化等心血管疾病的治療中體現(xiàn)出較好的臨床效果。

通過生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)平滑肌分化標志基因SM22α啟動子上含有ERE和CArG box位點，提示其可能是ERα和Myocardin轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因。但有關(guān)ERα和Myocardin在SM22α轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的相互關(guān)系，迄今尚未見報道。

本文通過構(gòu)建 SM22α-luc質(zhì)粒，在 VSMCs和COS-7細胞中，利用Luciferase Report Assay實驗證明了E2/ERα信號通路可通過抑制Myocardin對SMC標志基因 SM22α-luc的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進VSMCs由分化型向增殖型轉(zhuǎn)變。本研究的進一步深入開展，將有望為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等藥物的合理臨床應用提供新的理論指導。

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