楊金龍，程朝輝，劉雙，韓釗，侯圣陶

（溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.腦血管科；2.神經(jīng)生物研究所）

2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉〔2-（2-benzofuranyl）-2-imidazoline，2-BFI〕是1996年由Lione等[1]首次報道的一種新的、有選擇性的、高親和力的咪唑啉I受體（imidazoline receptor，IR）的配體。有報道稱，腦缺血再灌注損傷后早期給予2-BFI可以減輕神經(jīng)功能缺損，縮小腦梗死灶的體積，減少缺血半暗帶神經(jīng)細胞凋亡[2]。但2-BFI抗凋亡作用的具體機制尚不清楚。本研究用SD大鼠腦缺血再灌注損傷模型，于缺血再灌注后立即靜脈給予2-BFI進行干預，觀察其對凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響，探討2-BFI對大鼠缺血性再灌注腦損傷的抗凋亡作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康的雄性SD大鼠36只，二級動物，3～4月齡，體質(zhì)量240～280 g，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（滬）2007-0005。大鼠術前自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜，日光采光，光暗周期為12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～22℃。大鼠在造模前12 h禁食但不禁水。整個實驗過程中對于動物的飼養(yǎng)、用藥、手術及取材均嚴格遵循實驗動物科學管理的有關規(guī)定。

1.2 主要藥品與試劑 2-BFI（英國Tocris公司）；Bcl-2抗體和Bax抗體（美國Santa公司）；兔二步免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。

1.3 腦缺血再灌注模型的建立 參照Longa等[3]和Koizum等[4]的線栓法，稍加以改進，以左側(cè)為栓塞側(cè)。栓線采用尼龍魚線，長2.5 cm，前端燒灼并涂以薄層石蠟。線栓插入深度為距頸總動脈分叉處（1.85±0.05）cm，堵住大腦中動脈的起始部，在操作過程中，肛溫保持在36～37 ℃。術中適時用溫0.9%氯化鈉溶液浸潤術野，以防術野干燥，并觀察動物的生命體征是否平穩(wěn)。于術后120 min拔出線栓。假手術組分離頸總和頸內(nèi)、頸外動脈，并結(jié)扎頸總和頸外動脈，但不插入線栓。

1.4 實驗分組及給藥方法 24只大鼠，按完全隨機法分為假手術組、模型組、用藥組，每組各8只。大腦中動脈栓塞建模成功后，在動物清醒后行Longa 5分法[3]評分，1～3分的入組，并于手術后120 min時拔線，完成缺血再灌注模型。用藥組于拔線后立即經(jīng)尾靜脈注射3 mg/kg的2-BFI，假手術組、模型組經(jīng)尾靜脈注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標本采集 所有動物于用藥24 h后經(jīng)神經(jīng)功能評分后麻醉，各組經(jīng)心臟灌注后斷頭取腦后固定于4%多聚甲醛中浸泡24 h，而后沖水24 h，石蠟包埋備用。

1.6 Bcl-2、Bax蛋白的檢測 石蠟切片脫蠟、水化。純化水沖洗，PBS浸泡，高壓抗原修復后，依據(jù)試劑盒中的說明書，對Bcl-2、Bax蛋白用免疫組織化學技術進行檢測。光鏡下觀察，每張取5個視野，計數(shù)Bcl-2、Bax陽性細胞數(shù)，取其平均值。1.7 統(tǒng)計學處理方法 計量資料以±s表示，用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

Bcl-2、Bax陽性細胞呈棕黃色，胞漿染色。假手術組偶見Bcl-2陽性細胞，模型組和用藥組Bcl-2陽性細胞明顯增多，且用藥組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。假手術組偶見Bax陽性細胞，模型組Bax陽性細胞明顯增多，2-BFI用藥組Bax陽性細胞明顯減少且與模型組相比有明顯差異（P<0.01），見圖 1、表1。

表1 各組腦組織Bax和Bcl-2陽性細胞數(shù)（n=8，±s）

圖1 各組腦組織免疫組化Bcl-2陽性細胞和Bax陽性細胞的表達（DAB，×400）

3 討論

腦缺血再灌注損傷引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)和障礙，缺血中心區(qū)域的神經(jīng)元由于急性缺血低氧而迅速壞死，缺血半暗帶中一些細胞則會經(jīng)過一段時間后慢慢死亡，形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，這些細胞的死亡常常呈現(xiàn)出凋亡的特征。在整個凋亡過程，諸多原癌基因及其腫瘤前體基因參與其中，如p53、Bcl-2、Bax等。

目前普遍認為，Bcl-2是一種膜整合蛋白，主要分布在核膜（尤其是核孔復合體處）、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核周圍的膜性結(jié)構上，通過參與核內(nèi)外物質(zhì)的交換，在一定程度上抑制細胞色素C從線粒體上的釋放，減少鈣離子的釋放，阻斷細胞內(nèi)過氧化物堆積，因此Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用。Linnik等[5]發(fā)現(xiàn)Bcl-2過表達能夠?qū)鼓X缺血后的損傷，在局灶性腦缺血損傷后的大腦皮層中可見大量的Bcl-2陽性細胞，增加內(nèi)源性Bcl-2的表達有利于受損細胞的存活，反之則加重腦組織的損傷。Cao等[6]以脂質(zhì)體為載體，將人源性的Bcl-2導入局灶腦缺血后的大鼠的腦內(nèi)，發(fā)現(xiàn)梗死灶明顯減小，半暗帶的細胞凋亡亦明顯減輕。Bax又稱Bcl-2 相關蛋白X，是一種Bcl-2家族的前凋亡蛋白，分子量為20～26 kD，由192個氨基酸殘基組成，一般存在于細胞漿中。當細胞受到損傷或刺激后，它能起到傳感器的作用，可以重新定位于線粒體的表面并拮抗Bcl-2的功能。也有研究認為Bax可以通過與通透轉(zhuǎn)變孔蛋白共同作用，致使細胞色素C釋放，從而起到了促進細胞凋亡的作用。缺血腦組織中的Bax蛋白表達減少，對腦有一定的保護作用[7-8]。本實驗也發(fā)現(xiàn)Bax蛋白參與缺血后細胞凋亡，陽性細胞多位于缺血半暗帶區(qū)，用藥組陽性細胞明顯少于模型對照組（P<0.01），說明2-BFI能降低Bax蛋白的表達，對腦缺血再灌注有保護作用。

我們以往的研究發(fā)現(xiàn)咪唑啉I2受體（I2R）高親合力配體2-BFI對星形膠質(zhì)細胞糖氧剝奪損傷具有保護作用，抑制脂質(zhì)過氧化可能是其保護機制之一[9]，在腦缺血再灌注損傷大鼠模型給予2-BFI，能抑制細胞凋亡，表現(xiàn)出抗凋亡作用[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注后立即經(jīng)尾靜脈給以2-BFI，不僅可以上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，還能下調(diào)Bax蛋白的表達。這表明2-BFI對腦缺血再灌注損傷后的抗凋亡作用與2-BFI可以上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達和下調(diào)Bax蛋白的表達有關。

[1] Lione LA, Nutt DJ, Hudson AL. [3H]2-(2-benzofuranyl)-2-imidazoline: a new selective high affinity radioligand for the study of rabbit brain imidazoline I2receptors[J].Eur J Pharmacol,1996,304(1-3):221-229.

[2] Han Z, Xiao MJ, Shuo B, et al. Attenuation of ischemiainduced rat brain injury by 2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline,a high selectivity ligand for imidazoline I2 receptors[J].Neurol Res,2009,31(4):390-395.

[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4] Koizumi J, Yoshida Y, Nakazawa T, et al. Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke,1986,16(8):1-8.

[5] Linnik MD, Zahos P, Geschwind MD, et al. Expression of bcl-2 from a defective herpes simplex virus-1 vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia[J].Stroke,1995,26(9):1670-1675.

[6] Cao YJ, Shibata T, Rainov NG. Liposome- mediated transfer of the Bcl-2 gene results in neuroprotection after in vivo transient focal cerebral ischemia in an animal model[J].Gene Ther,2002,9(6):415-419.

[7] Yang D, Guo S, Zhang T, et al. Hypothermia attenuates ischemia/reperfusion-induced endothelial cell apoptosis via alterations in apoptotic pathways and JNK signaling[J]. FEBS Lett,2009,583(15):2500-2506.

[8] Antonsson B, Montessuit S, Sanchez B, et al. Bax is present as a high molecular weight oligomer/complex in the mitochondrial membrane of apoptotic cells[J]. J Biol Chem,2001,276(15):11615-11623.

[9] 田繼沙,韓釗,張紅霞,等.2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉對星形膠質(zhì)細胞糖氧剝奪損傷的保護及抗脂質(zhì)過氧化作用 [J]. 溫州醫(yī)學院學報,2010,40(6):560-563.

[10] Han Z, Zhang HX, Tian JS, et al.2-(-2-benzofuranyl)-2-imidazoline induces Bcl-2 expression and provides neuroprotection against transient cerebral ischemia in rats[J].Brain Res,2010,1361:86-92.