彭 濤，黃 姣，徐 凌

(1.重慶市黔江中心醫(yī)院口腔科 409000；2.重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科 401147；3.重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科 401147)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，MSCs)，由于其特有的成骨分化潛能，因而在骨組織工程領(lǐng)域中備受關(guān)注[1-2]。但是在組織工程實(shí)際應(yīng)用中，做為種子細(xì)胞移植入缺損處后，因?yàn)闆]有血管化的同步形成，最初處于一相對(duì)低氧環(huán)境中，因此研究MSCs的增殖和分化是否受缺氧或低氧環(huán)境影響具有重要的意義。近年有研究也發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)源性細(xì)胞均屬于氧感應(yīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過建立低氧-細(xì)胞培養(yǎng)模型，探討不同低氧分壓微環(huán)境對(duì)MSCs增殖及成骨向分化的影響，為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 (1)主要材料：α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胰蛋白酶、EDTA、牛血清清蛋白(BSA)，考馬斯亮藍(lán)(Sigma，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，MTT試劑(Gibco，美國)，二甲基亞砜(分析純，中國)，兔抗鼠SH3、CD34、CD44、CD54、CD105抗體，兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白(COLⅠ)抗體，生物素化山羊抗兔抗體(BOSTER，中國)，DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)公司，中國)。(2)主要儀器：25 cm2培養(yǎng)瓶、6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板(Corning，美國)；CO2孵育箱(Sanyo，日本)、Heraeus三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(Pierce，德國)、倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)、堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒(北京柏定生物工程有限公司)、Leica顯微鏡(德國)、圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 4.5(Media，美國)、HTS7000plus多孔板高效分析儀(PE，美國)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞來源和培養(yǎng) 取雄性4周齡SD大鼠，引頸法處死，無菌條件下取大鼠股骨，切除兩側(cè)的股骨端，用針管吸取5 mL含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，沖出骨髓，將其接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用巴氏吸管吹散細(xì)胞，然后置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。第7天換液，棄懸浮細(xì)胞。以后每3～4天換液1次，待原代細(xì)胞生長融合達(dá)到80%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第4代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。進(jìn)行免疫熒光染色，證實(shí)獲得SH3+、CD34-、CD44+、CD54+和CD105+的單核細(xì)胞為MSCs。

1.2.2不同低氧分壓下MSCs細(xì)胞增殖率的MTT法檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為低氧組和常氧組(21%)，低氧組再分2%、4%、6%、8%氧分壓組(分別為低氧1組、低氧2組、低氧3組、低氧4組)。取第4代MSCs消化后，用含10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)基配制成4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按照分組情況，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞放置于預(yù)先設(shè)置好氧分壓的三氣培養(yǎng)箱中，常氧組細(xì)胞放置于5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。3～4天換液1次。在1、3、5、7、9 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取出96孔板，采取MTT法，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長下測(cè)定其調(diào)零后的光吸收度值(OD值)。

1.2.3不同低氧分壓下MSCs細(xì)胞ALP活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2。取第4代MSCs消化后，配制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶里，每瓶加入2 mL細(xì)胞懸液，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)瓶。按照分組情況，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞放置于預(yù)先設(shè)置好氧分壓的三氣培養(yǎng)箱中，常氧組細(xì)胞放置于5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。3～4天換液1次。在1、3、5、7、9 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集需要檢測(cè)的細(xì)胞，待樣品全部收集完成后送檢。送檢前，反復(fù)凍融3次，形成凍融液。按試劑使用說明處理收集的樣本，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在405 nm波長下測(cè)定其OD值，再乘以系數(shù)1 383求出樣本中ALP活力(U/L)。同時(shí)相同辦法計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量(mg/mL)。最后計(jì)算單位蛋白含量的相對(duì)ALP活性，計(jì)算公式為：

1.2.4不同低氧分壓下MSCs細(xì)胞COLⅠ的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2。取第4代MSCs消化后，配制成1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于6孔板中的玻璃片上，每張加入1 mL細(xì)胞懸液，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5張復(fù)片。按照分組情況，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞放置于預(yù)先設(shè)置好氧分壓的三氣培養(yǎng)箱中，常氧組細(xì)胞放置于5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。3～4天換液1次。在1、3、5、7、9 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取出6孔板，采用streptavidin biotin-peroxidase complex method(SABC法)對(duì)MSCs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。第一抗體為COLⅠ兔抗鼠多克隆抗體，第二抗體為鏈酶親和素化山羊抗兔IgG。設(shè)置陰性對(duì)照(用PBS液代替一抗，其余條件不變)。采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色切片進(jìn)行檢測(cè)。在200倍顯微鏡下將每張切片按系統(tǒng)抽樣法隨機(jī)選擇4個(gè)視野測(cè)定棕黃色陽性顆粒的總面積及平均透光度。然后，通過計(jì)算平均積分光密度值(integrated optical density，IOD值)得出陽性染色強(qiáng)度，試算公式為：

平均IOD值=平均透光度×平均陽性面積 (2)

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)MSCs細(xì)胞增殖率結(jié)果 MSCs在低氧微環(huán)境中生長時(shí)，OD值均較其在常氧微環(huán)境中生長的OD值高，其中低氧2組最明顯。在第1、3天各低氧組的OD值變化幅度較小，至第5天各組的OD值變化幅度開始增加，第7、9天各低氧組OD值增加明顯，而常氧組OD值增加較平緩。各低氧組的OD值與常氧組比較，在第5、7、9天均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示低氧微環(huán)境能促進(jìn)MSCs的增殖活性。其中，在4%氧分壓為微環(huán)境中，MSCs增殖活動(dòng)最為活躍，但與其他各低氧組比較其OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2MSCs細(xì)胞ALP活性定量檢測(cè)結(jié)果 培養(yǎng)第1天時(shí)各低氧組與常氧組的MSCs細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)活性均較弱，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各低氧組與常氧組MSCs細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá)活性逐漸增強(qiáng)，常氧組的ALP表達(dá)活性變化幅度較大，而各低氧組升高較平緩。第3、5、7、9天時(shí)各低氧組與常氧組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在各個(gè)低氧組內(nèi)，第7、9天時(shí)低氧1組與低氧4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P<0.05)，見表2。

表1 各低氧組與常氧組MSCs細(xì)胞的OD值比較

表2 各組 MSCs細(xì)胞 ALP活性比較

表3 各組MSCs細(xì)胞內(nèi)COLⅠ的IOD值比較

2.3各組MSCs細(xì)胞COLⅠ免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 各低氧組MSCs細(xì)胞內(nèi)COLⅠ表達(dá)均較弱，常氧組COLⅠ表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)。隨著時(shí)間延長，各低氧組MSCs細(xì)胞內(nèi)COLⅠ增加較平緩，常氧組COLⅠ表達(dá)變化幅度相對(duì)較大。第7、9天時(shí)各低氧組與常氧組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但各時(shí)間點(diǎn)各低氧組內(nèi)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

3 討 論

在骨組織工程學(xué)應(yīng)用上，通常采用的方法是從體內(nèi)獲得一定數(shù)量的種子細(xì)胞，然后在體外進(jìn)行擴(kuò)增，之后將其附于一生物相容性以及力學(xué)性能良好的支架材料上，移植入體內(nèi)相應(yīng)組織缺損處進(jìn)行修復(fù)[1-3]。但是，以往通常忽略了一個(gè)這樣的問題，在體外擴(kuò)增時(shí)，細(xì)胞處于一個(gè)常氧(21%)狀態(tài)之下，而移植入體內(nèi)組織缺損處后，因?yàn)槿睋p組織血管化過程需要一定時(shí)間，所以種子細(xì)胞一開始是處于一個(gè)相對(duì)低氧的微環(huán)境中，以后隨著血管化的逐漸形成，微環(huán)境的氧分壓逐漸回升，但就骨組織而言，始終無法達(dá)到21%氧分壓的環(huán)境中[4-7]。因此，常常在體外實(shí)驗(yàn)中研究種子細(xì)胞(如MSCs)的增殖以及成骨向分化的生物學(xué)行為，這與將種子細(xì)胞置于低氧微環(huán)境中生長時(shí)的生物學(xué)行為相比，可能會(huì)有很大的出入。而研究低氧微環(huán)境下種子細(xì)胞增殖、成骨向分化的生物學(xué)行為，對(duì)于以后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究以及臨床應(yīng)用更有實(shí)際意義。因此本課題以此為出發(fā)點(diǎn)，設(shè)計(jì)研究MSCs在2%、4%、6%、8%、21%氧分壓環(huán)境下的增殖活性以及成骨向分化能力，為將其作為種子細(xì)胞應(yīng)用于牙周骨組織工程學(xué)上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)所選擇的氧分壓，本課題盡量模擬種子細(xì)胞移植入骨缺損處所經(jīng)歷的一個(gè)氧分壓變化。但是這個(gè)影響因素很多，如骨缺損的大小勢(shì)必會(huì)影響細(xì)胞所處的氧環(huán)境，缺損較大，相應(yīng)組織血管化就會(huì)減慢，多數(shù)細(xì)胞會(huì)較長時(shí)間處于低氧環(huán)境中，反之，缺損小，組織血管化進(jìn)程快，血管化面積大，相應(yīng)細(xì)胞就會(huì)處于一較高氧分壓的環(huán)境中；而且移植處組織的血流受阻情況也存在各種差異，這些也會(huì)影響到移植種子細(xì)胞所處的氧環(huán)境。有研究表明，骨髓組織為一相對(duì)缺氧組織，其氧分壓范圍為1%～7%。本課題選擇了氧分壓為2%、4%、6%、8%、21%作為細(xì)胞生長的微環(huán)境，一方面希望選擇的這個(gè)范圍能盡可能真實(shí)反映種子細(xì)胞移植到缺損處所經(jīng)歷的一個(gè)氧分壓變化范圍；另一方面也希望通過這幾個(gè)氧分壓的選擇，能研究出MSCs在不同氧分壓下生物學(xué)行為的一個(gè)變化規(guī)律，為以后的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中采取MTT比色試驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖率。MTT法的檢測(cè)原理是活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(商品名噻唑藍(lán)，簡稱MTT)還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，沉積在細(xì)胞中，用二甲基亞砜溶解細(xì)胞中的甲臜，最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長處測(cè)定其OD值，因?yàn)镸TT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系，所以該檢測(cè)方法可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)中MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，各低氧組對(duì)MSCs的增殖活性有明顯的促進(jìn)作用，在4%氧分壓時(shí)，其促進(jìn)作用最為明顯。這與國外有關(guān)研究結(jié)果一致，即低氧環(huán)境促進(jìn)MSCs的增殖[6，8-10]。從細(xì)胞增殖活性上看，低氧預(yù)處理的MSCs細(xì)胞作為種子細(xì)胞是相當(dāng)有利的。但是，也要考慮到的就是MSCs細(xì)胞處于低氧環(huán)境下的分化情況，特別是成骨向分化的情況，這也是本研究選用其作為種子細(xì)胞的重要原因。

眾所周知，成骨細(xì)胞早期分化的指標(biāo)之一就是ALP活性的增加。ALP可以水解有機(jī)磷酸酯，進(jìn)而釋放出磷酸鹽，使得游離的磷酸鹽與鈣發(fā)生結(jié)合，形成磷酸鈣，磷酸鈣再沉積在細(xì)胞周圍基質(zhì)的膠原中，最終形成了新生骨。眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沒有ALP的生成，骨組織鈣化就不會(huì)發(fā)生。從骨組織結(jié)構(gòu)來看，是由2/3的無機(jī)物和1/3的有機(jī)物構(gòu)成，其中COLⅠ就占到了有機(jī)物中的80%～90%，對(duì)骨組織結(jié)構(gòu)的完整、、生物力學(xué)的維持起著重要的作用。COLⅠ構(gòu)成骨組織的框架，其合成和分泌是骨組織形成的前提條件，加速它的合成分泌，可以明顯促進(jìn)骨組織的礦化進(jìn)程。因此，本實(shí)驗(yàn)選取ALP和COLⅠ作為檢測(cè)指標(biāo)，用于觀察MSCs細(xì)胞在不同低氧分壓下成骨向分化的情況。從本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以看出，低氧微環(huán)境抑制MSCs細(xì)胞ALP活性和細(xì)胞內(nèi)COLⅠ的表達(dá)，也抑制MSCs細(xì)胞成骨向分化，而且這種抑制作用與氧分壓有關(guān)，氧分壓越低其抑制作用越明顯。這與有關(guān)研究結(jié)果一致，即認(rèn)為低氧環(huán)境抑制MSCs內(nèi)ALP以及COLⅠ的表達(dá)，抑制MSCs成骨向分化[11-13]。 但也有研究卻認(rèn)為低氧環(huán)境能促進(jìn)MSCs內(nèi)ALP以及COLⅠ的表達(dá)[14-15]。其研究結(jié)果的差異性可能為細(xì)胞模型不同，或培養(yǎng)條件不同所造成。

以上實(shí)驗(yàn)說明在運(yùn)用組織工程學(xué)方法修復(fù)牙周骨缺損中，通過低氧預(yù)處理的MSCs細(xì)胞僅能增加其增殖活性但不利于MSCs細(xì)胞ALP活性和COLⅠ的表達(dá)，也極不利于MSCs細(xì)胞的成骨向分化。以后的研究應(yīng)該進(jìn)一步明確其抑制成骨向分化的作用機(jī)制，以期在體外細(xì)胞培養(yǎng)中加以干預(yù)，使其移植入缺損后更有利于骨組織的形成。

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