何冬蘭,王亞南,邵坤彥,葉 程

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430074)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase或TG)[1]在食品加工中具有一定的功能特性[2-4]. 20世紀(jì)90年代末，Ando[5]等首次發(fā)現(xiàn)Strepovertilliumsp.s-8112、S.mobaraense等具有產(chǎn)生微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)的能力，并首次用發(fā)酵法生產(chǎn)得到了MTG. 近2年, 有研究采用離子束誘變、紫外線及He-Ne激光復(fù)合誘變的方法對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株進(jìn)行選育研究[6,7]，效果均不太明顯.這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，不適合工業(yè)化生產(chǎn).利用基因工程的方法將MTG轉(zhuǎn)入到原核生物中進(jìn)行表達(dá)從一定程度上解決了MTG生產(chǎn)成本過(guò)高，產(chǎn)量不能滿足食品工業(yè)的需求等問(wèn)題.但原核生物對(duì)外源蛋白的表達(dá)存在一定的缺陷，需進(jìn)行復(fù)性方可獲得具有生物活性的目的蛋白.畢赤酵母菌是真核生物，能對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行加工[8-10],因此將MTG基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)直接產(chǎn)生有活性的目的蛋白.目前國(guó)內(nèi)外幾乎未見(jiàn)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶轉(zhuǎn)入真核生物中的研究. 本研究選用巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5k進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，將MTG基因插入pPIC3.5k中，轉(zhuǎn)入至畢赤酵母菌中，下一步將進(jìn)行載體的表達(dá)研究,以期待獲得能在畢赤酵母中表達(dá)的目的產(chǎn)物，由此用于解決工業(yè)生產(chǎn)中蛋白復(fù)性的麻煩.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5k為Invitrogen公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)菌株E.coliDH5a和鏈霉菌Streptomycessp.H197為本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 主要試劑

ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI和4 DNA連接酶均購(gòu)自Takara公司；DNA Marker購(gòu)自BBI公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司.其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3 引物

根據(jù)Streptomycessp. H197基因序列，設(shè)計(jì)如下帶酶切位點(diǎn)的上游引物和下游引物：

上游：BamHI CGTGGATCCGCCAGCGGCGGC

GACGGGGAAA；

下游：EcoRI CCGGAATTCTTACGGCCAGCCC

TGCTT, 引物合成由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司完成.

重組質(zhì)粒PCR鑒定引物合成，引物序列如下：

5′AOX1Primer GACTGGTTCCAATTGACAAGC；3′AOX1 Primer GCAAATGGCATTCTGACATCC，引物合成由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1Streptomycessp. H197基因組DNA的提取

挑取4℃平板保存的單菌落接種于20mL液體培養(yǎng)基中[11]，在30℃、200r/min條件下培養(yǎng)2～3d,采用改進(jìn)的微波法提取總基因組[12]. 將提取的基因組用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保存于-20℃冰箱.

1.2.2 PCR法對(duì)目的基因DNA的擴(kuò)增

將提取的總基因組做為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13,14]，PCR體系為25μL.

表1 PCR擴(kuò)增體系

反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行，程序設(shè)定為95℃預(yù)變性5min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 90s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，10℃保溫30min.

PCR產(chǎn)物0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用回收試劑盒將目的片段回收.

1.2.3 畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5k的提取

將pPIC3.5k/DH5α大量培養(yǎng)，采用堿裂解法取質(zhì)粒，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20℃保存.

1.2.4 PIC3.5k/MTG酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

對(duì)凝膠回收的MTG基因片段和pPIC3.5k質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳進(jìn)行凝膠回收純化獲得具有粘性末端的質(zhì)粒和目的片段，T4DNA連接酶連接，CaCl2法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coliDH5α，涂布于含Amp的低鹽LB平板進(jìn)行篩選，選擇重組菌落進(jìn)行質(zhì)粒小量制備[15-17].

1.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定

將重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定[18]，選用目的片段的上游和下游引物鑒定目的片段的大小，選用目的片段的上游引物和3′AOX1確定目的片段插入的方向是否正確.

將重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證.

2 結(jié)果及分析

2.1 MTG基因的PCR擴(kuò)增及其回收

由Streptomycessp. H197菌種提取的總基因組經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖1)于23kb處可見(jiàn)明亮的總DNA帶，說(shuō)明提取效果很好.以Streptomycessp. H197菌株的總DNA為模板, 以設(shè)計(jì)的上游引物和下游引物擴(kuò)增出約1.2kb的谷氨酰胺酶基因片段(見(jiàn)圖2), 將MTG基因擴(kuò)增體系擴(kuò)大進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳后切膠回收，利用DNA凝膠回收試劑盒(小量DNA片段快速膠回收試劑盒)對(duì)目的DNA片段進(jìn)行回收，并電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖3),約1.2kb處有一條亮帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒上確有擴(kuò)增的外源基因片段.

M：λDNA/HindⅢ marker；1-4：H197的總基因組

1，3，4，5，6：擴(kuò)增的目的片段；M：DL2000 marker

M：DL2000marker；1、2、3：MTG基因

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖4為酵母表達(dá)載體pPIC3.5k電泳圖譜. 由圖4可見(jiàn), 采用堿性裂解法由E.coli提取酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5k，酵母表達(dá)質(zhì)粒處于約9kb附近；圖5為載體和目的片段的雙酶切電泳圖譜. 由圖5可見(jiàn), 利用EcoRI和BamHI分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pPIC3.5k進(jìn)行雙酶切，酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5k雙酶切后位于9kb附近，PCR目的片段位于1.2kb附近，說(shuō)明擴(kuò)增和質(zhì)粒提取均獲成功；將酶切后的 MTG基因片段與具有粘性末端的酶切后的pPIC3.5k重組后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α細(xì)胞中.將轉(zhuǎn)化獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子采用堿裂解法提取質(zhì)粒并電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖6).質(zhì)粒大小位于10kb附近，說(shuō)明重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5k/MTG構(gòu)建成功.

1-4：酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5k；5：λDNA/Hindш Marker

1：pPIC3.5k；2：空泳道；3：目的片段；4：λDNA/ HindⅢ marker；5：DL2000 marker

M：λDNA/HindⅢ maker；1-4：重組質(zhì)粒pPIC3.5k/MTG

2.3 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證

圖7為重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證圖譜. 由圖7可見(jiàn)，將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行目的片段的上游引物和下游引物PCR，所得目的片段位于1.2kb附近(見(jiàn)圖7中1～4). 對(duì)重組質(zhì)粒鑒定采用上游引物和3'AOX1進(jìn)行PCR得到位于1.5kb附近的片段(見(jiàn)圖7中7～10)，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功且方向正確.將提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和BamHI雙酶切，得到位于9kb附近的pPIC3.5k質(zhì)粒和1.2kb附近的目的片段(見(jiàn)圖8)，進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

1-5：上游和下游引物擴(kuò)增片段；6：DL2000 marker；7-10：上游引物和3'AOX1擴(kuò)增片段

1：λDNA/HindⅢ maker；2-3：重組質(zhì)粒pPIC3.5k/MTG雙酶切；4：DL2000 marker

3 結(jié)語(yǔ)

MTG既可催化同種蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，也可催化不同蛋白質(zhì)之間的交聯(lián).由于組成各種蛋白質(zhì)的氨基酸種類互不相同，因而不同的蛋白質(zhì)中的限制性氨基酸不一定相同，通過(guò)MTG可將它們連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提高蛋白質(zhì)的功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外廣泛使用的一種新型表達(dá)系統(tǒng)[19]，該表達(dá)系統(tǒng)除具有真核表達(dá)系統(tǒng)所具有的特點(diǎn)外，還具有成本低、產(chǎn)量高及利于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn).因此本研究選用pPIC3.5k作為表達(dá)載體進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建，將MTG基因插入pPIC3.5k中，通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，MTG基因已正確連接到pPIC3.5k中，為MTG基因的真核表達(dá)奠定了一定的基礎(chǔ).

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