陳思禮, 梅 菊

(1 中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074；2 華中科技大學 環(huán)境科學與工程學院,武漢430074)

細菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)(TA)由位于同一操縱子中的有數(shù)堿基重疊的2個基因組成，前者編碼毒素蛋白，后者編碼抗毒素蛋白[1]，毒素蛋白可通過影響DNA 復制、mRNA穩(wěn)定性、蛋白合成、細胞壁生成以及 ATP形成過程抑制細胞生長甚至導致細胞死亡[2,3].E.coil染色體上的relBE操縱子中relB和relE基因分別編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白relB和穩(wěn)定毒素蛋白RelE，RelE毒性的激活依賴于蛋白酶Lon對RelB的降解，relB的同源基因存在于許多革蘭氏陽性和陰性的細菌染色體上[4,5].

水華魚腥藻(Anabaena, 屬Nostoc )是造成淡水水體水華污染的主要藻種之一，藻類水華污染的水體可導致鳥類等動物和水生生物以及人類疾病[6].當前對于細菌染色體上的毒素-抗毒素系統(tǒng)的生理功能存在不同的觀點，有關(guān)藍細菌中TA系統(tǒng)的研究報道不多見.本文通過分子生物學方法成功克隆并表達了魚腥藻PCC7120染色體基因asl4561和asl4562，為后續(xù)純化并研究兩蛋白之間的相互作用及其在魚腥藻PCC7120體內(nèi)的生理作用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥藻sp.PCC7120購自中國科學院水生物研究所，E.coilDH5α和E.coilBL21(DE3)為本實驗室保存，pMD18-T Vector為Takara公司產(chǎn)品，表達載體pET28a(+)為本實驗室保存. DNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等為Takara公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒DNA提取試劑盒均為Axygene產(chǎn)品. PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆片段的測序由南京金斯瑞生物科技有限公司測序確定.

1.2 實驗方法

1.2.1 PCC7120基因組DNA提取

參照文獻[7]方法提取基因組DNA.

1.2.2asl4561和asl4562基因的克隆

分子生物學操作按照標準方法進行[8].以PCC7120基因組DNA為模板，以asl4561-F和asl4561-R為引物(見表1)，Touch-down PCR擴增asl4561基因片段；以asl4562-F 和asl4562-R為引物(見表1)，Touch-down PCR擴增asl4562基因序列片段.PCR反應程序為94℃ 4 min；94℃ 1 min，55 ℃(0.5 ℃↓)40 s，72 ℃ 40 s，15個循環(huán)；94 ℃ 1 min，47 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，20個循環(huán)；72 ℃ 7 min.引物中添加相應的酶切位點，PCR擴增產(chǎn)物純化后與pMD18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化E.coilDH5α ，藍白斑篩選陽性克隆酶切鑒定測序正確后保存質(zhì)粒，分別命名為pMD18-T-4561和pMD18-T-4562.

表1 PCR引物及序列

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建

以XhoI和EcoRI分別雙酶切質(zhì)粒pMD18-T-4561和pET28a(+)，電泳回收片段，連接轉(zhuǎn)化E.coilBL21(DE3)，以含50 μg/mL硫酸卡拉霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，重組質(zhì)粒經(jīng)XhoI/EcoRI雙酶切鑒定，測序正確后命名為pET28a-4561.同理構(gòu)建的含asl4562基因的重組質(zhì)粒測序正確后命名為pET28a-4562.

1.2.4 目的蛋白的誘導表達

分別將含有重組質(zhì)粒pET28a-4561和pET28a-4562的BL21接種于含50 μg/mL硫酸卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)約3 h至OD600=0.4～0.6后加入1 mmol/L的IPTG于28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)8h，誘導目的蛋白表達. 離心收集沉淀加入2×SDS凝膠緩沖液，沸水浴5 min，離心取上清用5 %的濃縮膠和15 %的分離膠進行SDS-PAGE電泳檢測表達外源蛋白質(zhì)的分子量.

1.2.5 pET28a-4561的蛋白表達條件的優(yōu)化

1)最佳誘導時間試驗. 含重組質(zhì)粒pET28a-4561的BL21培養(yǎng)方法同上，當OD=0.4～0.6時，加入IPTG的終濃度為1.0 mmol/L、28℃振蕩培養(yǎng)，分別在2, 4, 6, 8, 10h取樣，離心收集沉淀，裂解后取上清SDS- PAGE電泳檢測蛋白表達量.

2)最佳IPTG濃度試驗.含重組質(zhì)粒pET28a-4561的BL21培養(yǎng)方法同上，當OD600=0.4～0.6時，每管加入IPTG的終濃度分別為0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L，28 ℃誘導6 h后，離心收集菌體，處理后取上清SDS-PAGE 電泳檢測蛋白表達情況.

2 結(jié)果

2.1 asl4561和 asl4562基因的克隆

通過Touch-down PCR擴增的asl4561和asl4562的基因片段產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果與預期大小(261bp和213bp)相符(見圖1). 基于設(shè)計asl4561基因引物時兩端外側(cè)多取了24個堿基以及有酶切位點及保護堿基，因此檢測結(jié)果約在250bp. pMD18-T-4561和pMD18-T-4562測序結(jié)果與NCBI所公布的asl4561和asl4562序列Blast比對，堿基完全相同說明成功克隆了兩目的基因.

M)DL2000標準Mark；1)asl4561PCR產(chǎn)物；2)asl4562PCR產(chǎn)物

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

根據(jù)pET28a(+)多克隆位點選取EcoRI/XhoI為插入位點，將asl4561和asl4562 PCR產(chǎn)物與pET28a(+)經(jīng)EcoR I/XhoI雙酶切、純化后的產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆菌液PCR檢測，并送測序發(fā)現(xiàn)asl4561和asl4562正確插入，插入片段分別為261bp和213bp，各自編碼87個和71個氨基酸.

2.3 目的蛋白的誘導表達檢測

含重組質(zhì)粒pET28a-4561和pET28a-4562的BL21分別在1 mmol/L的IPTG、28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h誘導表達，由SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果(見圖2)可見，分別在15kD上方和10-15kD之間有過量表達的蛋白帶.預測的asl4561和asl4562基因表達蛋白質(zhì)分子量大小分別為10.46kD和8.36kD，又因pET28a(+)表達載體的組氨酸標簽的密碼子和相應的酶切位點，使產(chǎn)生的融合蛋白的分子量增加5.19kD，故產(chǎn)生的目的蛋白分子量分別為15.65kD和13.55kD，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果大小與理論結(jié)果相符.

M)蛋白質(zhì)分子量標準； 1)空載體誘導； 2)pET28a-4561誘導表達； 3)pET28a-4562誘導表達

2.4 蛋白表達條件優(yōu)化結(jié)果

由圖2蛋白檢測圖可見，asl4562基因在細菌裂解液上清中表達量比較大，基本可以滿足后續(xù)的純化；但asl4561基因表達蛋白量并非特別大，可能因為誘導條件不適合. 因此首先考慮在誘導劑IPTG濃度和誘導時間上對該蛋白的表達條件進行優(yōu)化.

圖3為不同誘導時間對蛋白表達量影響. 由圖3可見，28 ℃、1.0 mmol/LIPTG誘導2 h取樣已有目的蛋白表達，而6 h表達量增至最大，之后無明顯增加，故可確定該蛋白最佳誘導時間為6 h.

M)蛋白質(zhì)分子量標準；1)空載體誘導后全菌； 2)未經(jīng)誘導的pET28a-4561轉(zhuǎn)化菌； 3～7)誘導時間依次為2, 4, 6, 8, 10 h的菌

圖4為不同IPTG濃度對蛋白表達量影響. 由圖4可見，在28 ℃下誘導6 h，當IPTG終濃度為0.4 mmol/L時，目的蛋白表達量最大，其余濃度的IPTG誘導表達量差異不太明顯，均無IPTG為0.4 mmol/L時誘導表達量大，故確定最佳IPTG濃度為0.4 mmol/L.

M)蛋白質(zhì)分子量標準； 1)空載體誘導后全菌；2)未經(jīng)誘導的pET28a-4561轉(zhuǎn)化菌；3～7)IPTG濃度依次為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L

3 分析與討論

不同種屬的細菌內(nèi)TA系統(tǒng)的基因序列可能同源性較低或相差很大，但其遺傳結(jié)構(gòu)和功能卻非常相似.本實驗首先通過序列分析發(fā)現(xiàn)PCC7120染色體基因asl4561與大腸桿菌染色體上毒素基因relE有較高的同源性，并與其上游基因asl4562有4個堿基的重疊，與TA系統(tǒng)具有相同的遺傳結(jié)構(gòu).通過對兩基因編碼產(chǎn)物的分析，推測它們在細胞生理條件下可通過靜電引力形成復合物，有相互作用，初步推測asl4561和asl4562基因構(gòu)成TA系統(tǒng).

通過分子生物學方法構(gòu)建的含asl4561基因的表達載體pET28a-4561和含asl4562基因的表達載體pET28a-4562，測序結(jié)果顯示兩基因完整的ORF均正確插入到pET28a(+)EcoR I/XhoI多克隆位點，無移碼突變和點突變，表明重組表達載體構(gòu)建成功.

蛋白檢測結(jié)果顯示兩基因表達蛋白均存在于菌體裂解液上清中，說明此類蛋白為可溶性蛋白.asl4562基因在28 ℃、1 mmol/LIPTG 誘導8 h，蛋白表達量較大.在對重組質(zhì)粒pET28a-4561表達條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)28 ℃、0.4 mmol/LIPTG 誘導6 h，其蛋白表達量最大，說明低溫、低濃度的IPTG誘導，可增加可溶性重組蛋白的產(chǎn)量[9].

近年研究證明TA系統(tǒng)作為原核細胞應對營養(yǎng)缺乏時的調(diào)控機制，是對細菌代謝調(diào)控的重要補充，對于設(shè)計新的藥物解決細菌耐藥性問題具有現(xiàn)實意義[10].但目前有關(guān)藍細菌中TA系統(tǒng)的研究還不多，本實驗結(jié)果為后續(xù)純化并研究兩蛋白之間的相互作用以及在它們魚腥藻PCC7120體內(nèi)的作用奠定基礎(chǔ).期望通過更深入的研究能為藍細菌染色體上其他TA系統(tǒng)的研究奠定基礎(chǔ)，由此入手可為除藻、解決水華問題提供新的思路.

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