藍(lán)麗丹 黃永輝 周 鵬

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

HPLC－MS/MS快速測(cè)定動(dòng)物肌肉中6種聚醚類抗生素

藍(lán)麗丹 黃永輝 周 鵬

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

建立動(dòng)物肌肉組織中6種聚醚類抗生素（莫能菌素、馬杜拉霉素、鹽霉素、和拉沙洛菌素、甲基鹽霉素、尼日利亞菌素）的高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定法。樣品經(jīng)乙腈提取，并以乙腈飽和的正己烷凈化，采用甲酸水溶液－甲醇體系為流動(dòng)相，梯度洗脫，電噴霧離子源正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下對(duì)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，各抗生素的回收率為88.0%～108.7%，RSD為2.3%～6.1% （C＝10μg/kg，n＝5），6種待測(cè)物在1.0～150ng/mL范圍內(nèi)均呈線性，線性回歸系數(shù)R2均大于0.99，檢出限為0.05～0.2μg/kg。該方法操作簡單，靈敏度高，適用于動(dòng)物肌肉組織中6種聚醚類藥物的批量檢測(cè)分析。

HPLC－MS/MS；聚醚類抗生素；動(dòng)物肌肉

聚醚類抗生素是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一類具有離子載體性質(zhì)的抗生素，此類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有許多醚基和一個(gè)一元有機(jī)酸，具有促進(jìn)離子通過細(xì)胞膜的能力，對(duì)多種球蟲有抑制作用，是目前廣泛應(yīng)用于畜禽飼養(yǎng)業(yè)的高效、廣譜抗球蟲藥和促生長劑。但聚醚類抗生素添加量過高會(huì)導(dǎo)動(dòng)物肌肉中藥物殘留，可能會(huì)通過食物鏈對(duì)人類身體健康產(chǎn)生危害，尤其可能會(huì)加劇心血管患者的病情。關(guān)于聚醚類抗生素殘留檢測(cè)研究的報(bào)道，主要有微生物法［1］、免疫 分 析 法［2］、液相色譜法［3－5］和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［6－12］。微生物法和免疫學(xué)法無法同時(shí)檢測(cè)多種藥物，且存在假陽性現(xiàn)象；由于聚醚類抗生素不具有紫外吸收官能團(tuán)，液相色譜紫外檢測(cè)法需要衍生化，操作相對(duì)繁瑣；而液相色譜－質(zhì)譜法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，可提供待測(cè)物的結(jié)構(gòu)信息，是檢測(cè)聚醚類抗生素較為理想的分析方法。本試驗(yàn)采用高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了動(dòng)物源肌肉組織中6種聚醚類藥物的高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，方法簡單快速，不需要衍生，不需要固相萃取凈化，檢出限低，具有良好的回收率和重現(xiàn)性，適用于動(dòng)物肌肉組織中聚醚類抗生素殘留的大批量檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莫能菌素、馬杜拉霉素、鹽霉素、拉沙洛菌素、尼日利亞菌素標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞95%，德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

甲基鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞97%，USP Reference Standard，USA；

乙腈、甲醇：色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司；

甲酸：優(yōu)級(jí)純，德國Merck公司；

正己烷：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

超純水：本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀：液相部分 Agilent 1290（配有1290自動(dòng)進(jìn)樣器、1290雙元泵、1290柱溫箱），質(zhì)譜部分 Agilent 6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有 Agilent Jet Stream ESI電噴霧離子源），美國安捷倫科技公司；

超聲振蕩器：DS－8510DTH，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；

高速離心機(jī)：Avanti J－E，德國Beckman公司；

電子分析天平：Sartorius BSA224S，塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；

旋渦混勻器：XH－B型，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；

色譜柱（50mm×2.1mm，i.d.，1.7μm）：Acquity BEH C18，美國 Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 稱取2.0g勻漿動(dòng)物肌肉樣品于50mL聚丙烯具塞離心管中，加入乙腈10mL，渦旋混勻1min，超聲提取10min后離心，取上清液備用，按以上步驟再提取1次，合并兩次提取液。將提取液濃縮至5mL左右，加入1mL乙腈飽和的正己烷，渦旋，待靜置分層后棄掉正己烷層，重復(fù)一遍。將凈化后的樣品氮吹至近干并以乙腈定容至2.0mL，離心，過0.22μm濾膜后利用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.2 色譜分析條件 Acquity BEH C18色譜柱；柱溫40℃；流動(dòng)相：A：0.3%甲酸水溶液；B：甲醇溶液；梯度洗脫條件：0～4min，B溶液由80%逐漸增至92%；4～5min，B溶液保持92%的含量；5.1～6.5min，B溶液保持80%的含量。流速為0.4mL/min；進(jìn)樣量：2.0μL。

1.3.3 質(zhì)譜分析條件 電噴霧離子源；正離子掃描（ESI＋）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣體溫度：325℃；氣體流量：5L/min；霧化氣壓力：310kPa；殼氣溫度：400℃；殼氣流量：12L/min；毛細(xì)管電壓：3 500V；噴口電壓：0V。碰撞能量及定性和定量離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇 聚醚類抗生素分子中含有多個(gè)環(huán)狀醚鍵，微溶或不溶于水，易溶于低級(jí)醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等。根據(jù)以上特點(diǎn)，選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷為提取劑，對(duì)比提取效果。用乙酸乙酯和正己烷提取，提取液中脂溶性共提物較多，為下一步凈化帶來困難。以甲醇提取，回收率較以乙腈提取差，乙腈具有很好的細(xì)胞穿透能力，既能得到滿意的回收率，又可以避免共提出太多的脂溶性雜質(zhì)，因此本試驗(yàn)選擇乙腈為提取劑。

表1 種聚醚類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)?Table 1 MS/MS parameter of 6polyether antibiotics

2.1.2 提取次數(shù)和提取劑用量的優(yōu)化 取2g樣品和1g無水硫酸鈉，每次以10mL乙腈提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取1次時(shí)回收率不穩(wěn)定，提取2次，回收率大于80%，第3次的提取液中基本未檢出待測(cè)物，因此，選擇的提取次數(shù)為兩次。圖1比較了5，10，15，20mL的乙腈提取對(duì)提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于拉沙洛菌素，提取效率隨提取溶劑的增加而增加，而對(duì)于其它5種聚醚類抗生素，以5mL提取液提取，提取不完全，提取率較低，以10mL提取兩次和以15mL提取兩次的效果相當(dāng)，當(dāng)提取液增至20mL時(shí)，提取率反而有所下降，這可能是由于共提取物增加，基質(zhì)抑制增強(qiáng)而導(dǎo)致的響應(yīng)降低。綜合考慮，本試驗(yàn)以乙腈為提取溶劑提取兩次，每次10mL進(jìn)行提取。

圖1 提取劑用量對(duì)提取效率的影響Figure 1 Effect of different extraction dosages

2.1.3 提取時(shí)間的優(yōu)化 比較了超聲提取5，10，20，30min等提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，如圖2所示，20min時(shí)已基本達(dá)到提取平臺(tái)，因此試驗(yàn)選擇的提取時(shí)間為20min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響Figure 2 Effect of the extraction time

2.2 凈化方式的選擇

固相萃?。⊿PE）是聚醚類抗生素檢測(cè)中常用的前處理方法［9－11］，本試驗(yàn)考察了固相萃取法與正己烷液－液萃取法的凈化效果，比較硅膠柱，C18固相萃取柱，石墨化炭黑固相萃取柱，中性氧化鋁柱，以及正己烷液－液萃取法對(duì)6種分析物的富集凈化效果。試驗(yàn)表明，采用硅膠柱，標(biāo)樣回收率基本在90%以上，但實(shí)際樣品的加標(biāo)回收卻很差，只有30%左右，這可能是由于肉制品基質(zhì)復(fù)雜，內(nèi)源性物質(zhì)較多，與待測(cè)物產(chǎn)生了競(jìng)爭吸附而導(dǎo)致待測(cè)物的回收率下降。采用C18固相萃取柱，石墨化炭黑柱，中性氧化鋁柱時(shí)，需要進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換，將乙腈提取液濃縮并轉(zhuǎn)換為極性較大的溶液后再進(jìn)行過柱凈化，操作較為復(fù)雜，費(fèi)時(shí)。將合并的提取液濃縮至5mL左右，以乙腈飽和的正己烷對(duì)提取液液－液萃取凈化，無需過固相萃取柱，6種待測(cè)物回收率均大于80%，且以正己烷凈化，具有處理簡單，快速，回收率高，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)，因此，本試驗(yàn)最終以正己烷對(duì)提取液液液凈化。與由于待測(cè)物在正己烷中具有一定的溶解性，因此試驗(yàn)優(yōu)化了凈化過程中正己烷的用量，向提取液中加入正己烷，每次1mL，渦旋，靜置分層后棄掉正己烷層，只進(jìn)行一遍凈化操作，對(duì)含油量大的基質(zhì)除油不完全，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，凈化兩遍，6種化合物的回收率均大于80%，凈化3遍，鹽霉素和甲基鹽霉素?fù)p失較多，回收率下降，因此，本試驗(yàn)最終以正己烷凈化2次，每次1mL。凈化后的樣品濃縮至近干，考查乙腈，甲醇，80/20甲醇/水等不同定容液對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)幾種定容液無明顯區(qū)別，為方便操作，試驗(yàn)采用乙腈將氮吹后的樣品定容至2.0mL，離心，過0.22μm濾膜后利用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

分別用1μg/mL的莫能菌素、馬杜拉霉素、鹽霉素、甲基鹽霉素、尼日利亞菌素和拉沙洛菌素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定母離子（尼日利亞菌素母離子為［M＋NH4］＋，其余5種抗生素母離子均為［M＋Na］＋）。對(duì)被測(cè)物的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到子離子質(zhì)譜圖，選擇監(jiān)測(cè)離子，并優(yōu)化碰撞能量；最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式優(yōu)化毛細(xì)管電壓，氣體溫度，氣體流量，殼氣溫度，殼氣流量，噴口電壓等質(zhì)譜參數(shù)。以子離子在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件下二者的相對(duì)豐度比和質(zhì)譜色譜峰的保留時(shí)間來定性，以定量離子峰面積按外標(biāo)法定量。質(zhì)譜參數(shù)及母離子和子離子詳見表1。

2.4 色譜條件的選擇

選用通用性強(qiáng)的 Acquity Uplctm BEH C18（50 ×2.1 mm i.d.，1.7μm）色譜柱，以甲醇：水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)物有較好分離，但峰型不對(duì)稱，有拖尾現(xiàn)象，將甲酸含量增加至0.3%，峰形得到有效改善，且6種聚醚類抗生素的總離子流圖色譜響應(yīng)值有不同程度的提高，因此本研究選擇以甲醇和0.3%甲酸作為流動(dòng)相。為使待測(cè)物分離效果好，峰形尖銳、出峰時(shí)間較短，試驗(yàn)采用梯度洗脫的方法進(jìn)行分離。比較了不同梯度洗脫的分離效果，確定了最佳的梯度洗脫程序（見1.3.2）。在最佳的色譜，質(zhì)譜條件下，6種待測(cè)物的選擇離子流圖見圖3。

圖3 6種待測(cè)物的選擇離子流圖Figure 3 TIC chromatograms of 6polyether antibiotics

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法的線性范圍和檢出限 基質(zhì)抑制效應(yīng)在液質(zhì)分析中表現(xiàn)明顯，不同物質(zhì)受到的影響程度有較大差異，因此本試驗(yàn)采用基質(zhì)加標(biāo)的方式進(jìn)行方法學(xué)考察，選擇空白樣品，按上述優(yōu)化好的提取凈化條件處理并定容得空白基質(zhì)，在優(yōu)化的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜條件下，配制系列濃度為1～200ng/mL的聚醚類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)行分析。根據(jù)不同質(zhì)量濃度下得到的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算得出該方法的最低檢出限。所建立的方法線性好，線性回歸系數(shù)R2均大于0.99，檢出限為0.05～0.2μg/kg，結(jié)果見表2。作為比較，表3列出了其它文獻(xiàn)中聚醚類抗生素的前處理方法和檢出限，可以看出，本方法無需固相萃取，具有操作簡單快速，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于聚醚類抗生素殘留的大批量檢測(cè)處理。

表2 6種聚醚類抗生素的線性范圍和檢出限Table 2 Regression equation，correlation coefficient and linear range of 6polyether antibiotics

表3 不同文獻(xiàn)中聚醚類抗生素的凈化方法和檢出限Table 3 Purified method and detection limits for polyether antibiotics in different references

2.5.2 回收率試驗(yàn) 為考察樣品處理方法的可靠性，分別在雞肉，兔肉樣品中加入3個(gè)不同質(zhì)量水平的聚醚類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，譜圖見圖4及圖5，不同加標(biāo)水平回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4及表5。結(jié)果表明，在優(yōu)化的條件下對(duì)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，各抗生素的回收率為88.0%～108.7%，RSD為2.3%～6.1% （n＝5），結(jié)果滿意。

2.6 方法應(yīng)用

用本試驗(yàn)建立的方法對(duì)購自福州超市的5份雞肉，5份豬肉，5份兔肉進(jìn)行檢測(cè)，其中1份雞肉檢出馬杜霉素殘留，2份兔肉檢出莫能菌素殘留，但殘留量均不超過5μg/kg，低于中國規(guī)定的最高殘留限量。

圖4 雞肉空白樣品的TIC色譜圖Figure 4 TIC chromatograms of blank chicken muscle

圖5 兔肉空白樣品的TIC色譜圖Figure 5 TIC chromatograms of blank rabbit muscle

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙腈直接提取，正己烷凈化，HPLC快速分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，成功建立了動(dòng)物肌肉組織中莫能菌素、馬杜拉霉素、鹽霉素、和拉沙洛菌素、甲基鹽霉素、尼日利亞菌素等6種聚醚類抗生素的快速檢測(cè)方法。方法簡單快速，不需要衍生，不需要固相萃取凈化，檢出限低，具有良好的回收率和重現(xiàn)性，適用于動(dòng)物肌肉組織中聚醚類抗生素殘留的大批量檢測(cè)分析。

表4 雞肉樣品的加標(biāo)回收率及精密度（n＝5）Table 4 Recoveries and precisions of polyether antibiotics in blank chicken muscle（n ＝ 5）

表5 兔肉樣品的加標(biāo)回收率及精密度（n＝5）Table 5 Recoveries and precisions of polyether antibiotics in blank rabbit muscle（n ＝5）

1 李娜，孫潔，祁克宗，等.雞肌肉組織中鹽霉素殘留的微生物法檢測(cè)研究［J］.飼料工業(yè)，2008，29（3）：45～48.

2 Hagren V，Peippo P，Tuomola M，et al.Rapid time－resolved fluoroimmunoassay for the screening of monensin residues in eggs［J］.Anal.Chim.Acta.，2006，557：164～166.

3 項(xiàng)新華，涂曉明，賈明宏，等.高效液相色譜法檢測(cè)動(dòng)物組織中馬杜霉素殘留［J］.中國公共衛(wèi)生，2002，18（1）：101～102.

4 陳明，陳美琴，耿志明，等.飼料中聚醚類抗生素的柱后衍生同時(shí)測(cè)定方法研究［J］.中國飼料，2005（20）：27～29.

5 陳明，陳美琴，耿志明，等.雞蛋中聚醚類抗生素殘留檢驗(yàn)方法研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2006，6（5）：124～128.

6 Ramsey E D，Rees A T，Wei G，et al.Direct aqueous supercritical fluid extraction coupled on－line with liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of polyether ionophore antibiotics in water［J］.J.Chromatogr A，2010，1 217：3 348～3 356.

7 Cheneau E D，Bessiral M，Roudaut B，et al.Validation of a multi－residue liquid chromatography－tandem mass spectrometry confirmatory method for 10anticoccidials in eggs according to Commission Decision 2002/657/EC ［J］.J.Chromatogr A，2009，1 216：8 149～8 157.

8 Vincent U，Chedin M，Yasar S，et al.Determination of ionophore coccidiostats in feedingstuffs by liquid chromatography–tandem mass spectrometry Part I.Application to targeted feed［J］.J.Pharm.Biomed.Anal.，2008，47：750～757.

9 薄海波，雒麗麗，曹彥忠，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶和奶粉中6種聚醚類抗生素殘留量［J］.分析化學(xué)，2009，37（8）：1 161～1 166.

10 梁春來，程林麗，沈建忠，等.液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞組織中5種聚醚類藥物殘留［J］.色譜，2009，227（6）：815～819.

11 畢言鋒，徐倩，王樹槐，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中的4種聚醚類抗球蟲藥物殘留［J］.分析試驗(yàn)室，2009，28（7）：17～21.

12 Dubois M，Pierret G，Delahaut Ph.Efficient and sensitive detection of residues of nine coccidiostats in egg and muscle by liquid chromatography－electrospray tandem mass spectrometry［J］.J.Chromatogr B，2004，813：181～189.

Fast determination of polyether antibiotics residues in animal muscle tissues by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

LAN Li－dan HUANG Yong－h(huán)uiZHOU Peng

（Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350002，China）

A high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry（HPLC－ESI MS/MS）method for the determination of six polyether antibiotics （monensin，maduramicin，salinomycin，lasalocid，narasin and nigericin）in animal muscle tissues was established.Polyether antibiotics in animal muscle tissues were extracted with acetonitrile and then cleaned up with n－h(huán)exane being saturated by acetonitrile.The analytes were separated using formic acid aqueous solution－methanol system as mobile phase with a linear gradient elution program，and the quantification was carried out by positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring（MRM）mode.Under the optimized conditions，the average recoveries for six polyether antibiotics ranged from 88.0%～108.7%，the limits of detection were in the range of 0.05～0.2μg/kg with precisions（RSDs（%），C＝10μg/kg，n＝5）ranging from 2.3%to 6.1%，and all of the analysis compounds exhibited good linearity over a range of 1.0～150ng/mL with the correlation coefficient over 0.99.Experiment results showed that the method was simple，rapid，sensitive and was applicable to simultaneous determination of multi－residues of six polyether antibiotics in animal muscle tissues.

HPLC－MS/MS；polyether antibiotics；animal muscle

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.036

藍(lán)麗丹（1983－），女，福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院工程師，碩士。E－mail：lanld112＠gmail.com

2011－08－01