王文淵唐守勇龍紅萍

（1.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425000；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410013）

超臨界CO2流體萃取苦瓜葉中黃酮的研究

王文淵1唐守勇1龍紅萍2

（1.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州 425000；2.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410013）

研究超臨界流體萃取苦瓜葉黃酮的影響因素，并對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。在單因素試驗和正交試驗的基礎(chǔ)上，得到超臨界萃取工藝的最優(yōu)化條件：以用量為1∶1（V∶m）的95%乙醇浸潤1h，夾帶劑體積與原料質(zhì)量比2∶1，CO2流量22L/h、萃取壓力28MPa、萃取溫度44℃，萃取時間150min。該工藝條件下，黃酮的提取率可達(dá)到3.69%。

超臨界；苦瓜葉；黃酮；提取

苦瓜又名癩葡萄、涼瓜，因有特殊苦味而得名，研究［1－4］表明，苦瓜的果實和莖葉中富含黃酮；苦瓜黃酮具有抗癌防癌、降血糖、血脂、抗心律失常和增強免疫力等有多種生理和藥理功效，因其獨特的功效可作為治療心腦血管疾病的藥物［5］。苦瓜黃酮還具有清除自由基抗氧化和抗衰老作用［6］，是一種天然的抗氧化劑，可用作為食品中的天然添加劑［7］，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域中有著廣泛的用途。目前，對苦瓜中的多糖、皂苷等生物活性成分研究的較多，而對苦瓜莖葉中黃酮類物質(zhì)研究報道的較少。

超臨界CO2萃取作為近年來發(fā)展的一種集萃取、分離于一體的新興提取技術(shù)，具有提取條件溫和、活性成分不易被破壞、消耗少、傳質(zhì)速率快、溶劑殘留少等優(yōu)點［8］，且最終的提取效率和經(jīng)濟性同水提法、有機溶劑提取法、微波法、超聲波法等常規(guī)方法相比也有很大提高，被廣泛應(yīng)用在天然產(chǎn)物有效成分的提取中［9］。本試驗以苦瓜葉為原料，先用乙醇進(jìn)行浸潤預(yù)處理，然后采用超臨界流體萃取技術(shù)提取其中黃酮，并與固體直接進(jìn)料方式的試驗結(jié)果進(jìn)行比較，以期得到更高效的提取苦瓜葉中黃酮類化合物的工藝。為充分利用苦瓜葉中的生物活性物質(zhì)－苦瓜黃酮，提供一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

苦瓜葉，采自永州市農(nóng)科所蔬菜園區(qū)，干燥粉碎，過40目篩，裝瓶備用；

CO2（純度≥99.5%）：食品級，永州市醫(yī)用氧氣廠；

蘆丁對照品：批號100080，中國藥品生物制品檢定所；

無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑：均為國產(chǎn)分析純；

二次蒸餾水：本實驗室自制；

超臨界萃取裝置：HA221－40，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

紫外－可見分光光度計：UV－9100，上海民儀電子有限公司；

高速萬能粉碎機：FW－100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：AEU－210，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

苦瓜葉→干燥→粉碎→稱量→乙醇浸潤→超臨界萃取→合并萃取物→減壓濃縮→黃酮提取液

1.2.2 操作要點

（1）原料預(yù)處理：新鮮苦瓜葉經(jīng)漂洗、陰干，于65℃烘箱內(nèi)干燥12h后取出，粉碎，過40目篩。稱取50.0g苦瓜葉粉于250mL三角瓶中，按用量為1∶1（V∶m）加入95%乙醇浸潤1h。

（2）超臨界CO2流體萃取：將經(jīng)過乙醇浸潤的苦瓜葉粉通過料筒裝入萃取釜，以95%乙醇為夾帶劑，按預(yù)定的設(shè)計調(diào)節(jié)CO2流量、萃取釜的壓力和溫度，設(shè)定分離釜I壓力8MPa，溫度40℃，分離釜Ⅱ壓力6MPa，溫度45℃，萃取一定的時間，每隔30min收集萃取物，合并萃取物，減壓濃縮得樣品溶液。

1.2.3 黃酮提取的單因素試驗

（1）夾帶劑及其用量的確定：使用加夾帶劑可提高苦瓜黃酮的提取率，根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，并考慮安全性、成本等因素，確定以95%的乙醇作為夾帶劑。再固定CO2流量20L/h，萃取壓力25MPa，萃取溫度50℃，萃取時間150min，夾帶劑的用量分別控制為1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1（V∶m），以黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察夾帶劑用量對黃酮提取率的影響。

（2）萃取壓力對黃酮提取率的影響：以95%的乙醇作為夾帶劑，固定 CO2流量20L/h，溫度50℃，夾帶劑用量2∶1（V∶m），萃取時間120min，萃取壓力分別控制為16，18，20，22，24，26，28，30，32MPa，以黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察萃取壓力對黃酮提取率的影響。

（3）萃取溫度對黃酮提取率的影響：以95%的乙醇為夾帶劑，固定CO2流量20L/h，壓力22MPa，時間120min，夾帶劑用量2∶1（V∶m），萃取溫度分別控制為32，34，36，38，40，42，44，46，48，50℃，以黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察萃取溫度對黃酮提取率的影響。

（4）萃取時間對黃酮提取率的影響：以95%的乙醇為夾帶劑，固定CO2流量20L/h，溫度44℃，壓力28MPa，夾帶劑用量2∶1（V∶m），萃取時間分別控制為60，90，120，150，180，210，240min，以黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察萃取時間對黃酮提取率的影響。

（5）CO2流量對黃酮提取率的影響：以95%的乙醇作為夾帶劑，固定溫度44，壓力28MPa，時間150min，夾帶劑用量2∶1（V∶m），CO2流量分別控制為15，18，21，24，27，30，33L/h，以黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察CO2流量對黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗設(shè)計方案 根據(jù)各單因素試驗結(jié)果確定正交試驗的因素及水平取值范圍，再設(shè)計L9（34）正交試驗，以黃酮提取率為評價指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化苦瓜葉黃酮的超臨界CO2流體萃取工藝參數(shù)。

1.2.5 總黃酮含量的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用 NaNO2－Al（NO3）3化學(xué)絡(luò)合分光光度法［10］，以蘆丁對照品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：

式中：

A——吸光度；

Y——蘆丁濃度，mg/mL；

（2）樣品中總黃酮含量的測定：精密取適量黃酮提取液于25mL容量瓶中，其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法相同，測定吸光度值，照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算總黃酮的含量，按式（2）計算提取率：

式中：

Y——黃酮提取率，%；

C——被測液黃酮濃度，mg/mL；

V1——測定時吸取的黃酮提取液體積，mL；

V——黃酮提取液的總體積，mL；

M——原料粉質(zhì)量，g；

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 夾帶劑用量對黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著夾帶劑用量的增加，黃酮提取率先增加后減少。這是因為夾帶劑的加入，改善了超臨界流體對黃酮的溶解性和選擇性，但用量過多，反而會使超臨界CO2流體的滲透力減弱。因此，只有夾帶劑量適當(dāng)，才能達(dá)到理想的萃取效果，可以看出，當(dāng)夾帶劑用量為2∶1（V∶m）時黃酮提取率最高。

圖1 夾帶劑用量對黃酮提取率的影響Figure 1 Effect of amount of entrainer on extraction rate of flavonoids

2.1.2 萃取壓力對黃酮提取率的影響 由圖2可見，隨著萃取壓力的提高，溶劑的溶解能力增強，黃酮提取率增大。當(dāng)壓力增大到一定程度時，繼續(xù)增加壓力，超臨界流體的黏度增加，使得流體的傳質(zhì)速率下降，影響萃取效果，當(dāng)壓力＞28MPa時，提取率呈降低趨勢。

2.1.3 萃取溫度對黃酮提取率的影響 由圖3可知，在其它條件恒定的情形下，黃酮提取率先隨溫度的升高而增大，44℃時達(dá)到最大值，而后開始下降，這是因為密度變化引起的溶解能力占主導(dǎo)所致［11］。

2.1.4 萃取時間對黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著萃取時間的延長，溶劑的傳質(zhì)能力逐步達(dá)到良好狀態(tài)，萃取量逐漸增加，萃取率增大，至150min時達(dá)到較大值。當(dāng)黃酮基本溶出，繼續(xù)延長萃取時間，萃取率增幅不大。

圖2 萃取壓力對黃酮提取率的影響Figure 2 Effect of extracting pressure on the extraction rate of flavonoids

圖3 萃取溫度對黃酮提取率的影響Figure 3 Effects of extracting temperature on the extraction rate of flavonoids

圖4 萃取時間對黃酮提取率的影響Figure 4 Effect of extracting time on the extraction rate of flavonoids

2.1.5 CO2流量對黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著CO2流量的增加，流體的湍流和擾動加強，增加了流體分子與溶質(zhì)間的碰撞機會，萃取速率提高。但流量過大，會使超臨界流體與待萃取組分接觸時間減少，影響萃取效果。CO2流量對黃酮提取率的影響呈拋物線形，流量為21L/h時，黃酮提取率最高。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果確定用量為2∶1（V∶m），選取萃取溫度、壓力、時間、CO2流量四因素進(jìn)行正交試驗優(yōu)化研究，以確定超臨界流體萃取的最優(yōu)化工藝，正交試驗的因素及水平取值見表1，結(jié)果見表2。

圖5 CO2流量對黃酮提取率的影響Figure 5 Effect of CO2flow on the extraction rate of flavonoids

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 超臨界流體萃取苦瓜葉總黃酮正交試驗結(jié)果與極差分析Table 2 The results and analysis of orthogonal test

由表2可知，萃取溫度、壓力、時間、CO2流量四因素對黃酮提取率影響的主次順序：萃取壓力＞溫度＞CO2流量＞萃取時間?？喙先~中黃酮的超臨界流體萃取最佳工藝條件是：A2B2C3D2，即萃取壓力28MPa，溫度44℃，CO2流量22L/h，萃取時間150min。

2.3 驗證實驗

按正交試驗確定的最佳提取工藝條件，進(jìn)行3次重復(fù)試驗，黃酮提取率分別為3.70%，3.65%，3.81%，平均提取率為3.72%，與理論預(yù)測值的相對誤差為1.06%，表明正交試驗得出的最優(yōu)工藝是符合實際的。

3 結(jié)論

（1）前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，在相同條件下對原料進(jìn)行乙醇浸潤預(yù)處理以后進(jìn)行超臨界萃取，比直接固體進(jìn)料進(jìn)行超臨界萃取黃酮平均提取率高28%以上。

（2）超臨界流體萃取苦瓜葉中總黃酮的最佳工藝條件為：以用量為1∶1（V∶m）的95%乙醇對原料進(jìn)行浸潤1h（預(yù)處理），用量為2∶1（V∶m）的95%乙醇為夾帶劑，控制CO2流量22L/h，壓力28MPa，溫度44℃，循環(huán)萃取150min。

1 申湘忠，楊民生.苦瓜植株各部分黃酮的提取與粗黃酮含量的測定［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26（1）：60～64.

2 計紅芳，張令文，孫科祥.苦瓜總黃酮的提取工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30（5）：77～81.

3 楊恩昌，張玉軍，王清路.苦瓜有效成分及其功能的研究進(jìn)展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（1）：162～164.

4 鄧儉英，方鋒學(xué)，程亮.苦瓜的藥用價值及其利用［J］.中國食物與營養(yǎng)，2005（1）：48～49.

5 吳德雨，黃榮清，駱傳環(huán)，等.苦瓜中活性成分及藥理藥效［J］.科學(xué)技術(shù)與工程，2005，17（5）：1 282～1 285.

6 劉葦芬，文良娟.苦瓜抗氧化活性成分的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22（2）：95～97.

7 張炳楨，彭艷麗，李亮.苦瓜的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.食品與藥品，2006，8（4）：27～30.

8 梁健欽，楊煥琪，熊萬娜，等.超臨界CO2萃取砂糖桔葉揮發(fā)油及其GC－MS分析［J］.食品與機械，2010，26（3）：28～30.

9 張瑞菊，張國英，孫海波，等.苦參中黃酮類組分的提取及抗氧化性的研究［J］.食品與機械，2009，25（4）：68～71.

10 王敏，高錦明，王軍，等.苦蕎莖葉粉中總黃酮酶法提取工藝研究［J］.中草藥，2006，37（11）：1 645～1 648.

11 岳紅，趙曉莉，張穎.超臨界二氧化碳萃取柿葉黃酮的工藝研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2005，17（3）：421～423.

Study on extraction of flavones frommomordica charan tialeaves L.by supercritical CO2fluid

WANG Wen－yuan1TANG Shou－yong1LONGHong－ping2

（1.Hunan Yongzhou Vocational Technical College，Yongzhou，Hunan425000，China；2.School of Pharmacy，Central South University，Changsha，Hunan410013，China）

The extraction technology of flavonoids frommomordica charantialeaves L.by supercritical CO2fluid was studied and the processing parameters were optimized.Based on the single experiments and orthogonal tests，the optimal process conditions were as follows：soak the matrix by 95%ethanol（contrast to matrix 1∶1）for one hour，95%ethanol（contrast to matrix 2∶1）serve as entrainer.CO2flow rate 22L/h，extracting pressure 28MPa，extracting temperature 44 ℃，and extracting time 150min.The yield of flavonoids was 3.69%under the optimal condition.

SFE；momordica charantialleaves；flavonoids；extraction

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.024

湖南省教育廳重點項目（編號：09C1294）

王文淵（1969－），男，湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院副教授。E－mail：wwy07＠163.com

2011－05－01