范曉紅，李治建，斯拉甫·艾白，3，劉發(fā)，周露，孟繁龍

(1.新疆石河子大學藥學院，832000;2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049;3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830049)

沒食子(Turkish galls)為殼斗科植物沒食子樹(Quercus infectoria oliv.)幼樹上的蟲癭，由沒食子蜂(Cynips gallae-tinctoriae oliv.)寄生而形成。藥材主要藥用成分為沒食子鞣質、沒食子酸等活性成分。沒食子中富含沒食子鞣質，沒食子鞣質具有多方面藥理活性，具有抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調節(jié)等作用［1-3］。沒食子鞣質極不穩(wěn)定，容易在酸、堿、酶的催化作用下水解，不同溶劑和不同提取方法直接影響沒食子鞣質的藥效。筆者對沒食子鞣質的提取分離進行了初步優(yōu)選，以沒食子酸提取率為指標，建立簡便、準確的高效液相色譜(HPLC)法含進行量測定。通過比較不同方法提取沒食子鞣質對小鼠淋巴細胞增殖反應和對腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響的研究，分析沒食子鞣質的最佳提取工藝，為沒食子的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀:Waters1525二元泵高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，Empower數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(美國);Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);MCO-175二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱;XD-101倒置顯微鏡;550-BIORAD酶標儀(美國)。

1.2 試藥 沒食子藥材品種由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗所中藥室鑒定;沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110831-200803);甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 沒食子鞣質提取工藝研究

2.1.1 水和80%丙酮浸泡提取 取過孔徑250μm(4號)篩沒食子藥材粉末兩份，每份50 g，加水和80%丙酮室溫浸泡提取3次，水提取每次30 min，丙酮提取每次浸泡2 d。提取液合并減壓濃縮，真空干燥后，加適量水混懸，用乙醚提取，水層部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，真空干燥，干燥溫度不超過50 ℃［4-5］。

2.1.2 甲醇超聲提取 沒食子粉末(過孔徑250μm篩)50 g經70%甲醇超聲處理1 h，室溫避光浸泡24 h，提取3次。合并濾液，減壓濃縮，真空干燥得浸膏，加適量水混懸，用乙醚提取，水層部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，得浸膏［6］。

2.1.3 乙醇攪拌提取 取干燥的沒食子粉末(過孔徑250μm篩)50 g，置棕色瓶中，經50%乙醇室溫攪拌提取1 h，提取3次，減壓濃縮，回收乙醇。真空干燥后加適量水混懸，用乙醚提取，水層部位再用乙酸乙酯提取，回收乙酸乙酯，得浸膏［7］。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相:A相:0.2%磷酸(H3PO4)溶液;B相:甲醇(CH3OH)，A∶B=90∶10，柱溫:30℃檢測波長:275 nm，進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥恒重的沒食子酸對照品25.0 mg，置50 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度(每毫升中含沒食子酸0.50 mg)。

2.2.3 供試品溶液的制備 取精密稱取原藥材粉末(過孔徑250μm篩)、甲醇提取物、丙酮提取物、水提取物、乙醇提取物各0.5 g，加入4 mol·L-1鹽酸溶液50 mL，水浴中加熱，水解3.5 h，定容至100 mL(原藥材要經過濾之后定容)，后精密稱取2 mL，置250 mL棕色量瓶中，加水至刻度，搖勻即得樣品溶液［8］。

2.2.4 樣品含量測定 樣品溶液和對照品溶液分別用孔徑0.45μm的微孔濾膜過濾后，分別進樣10μL，注人色譜柱，按上述色譜條件測定。以外標一點法計算各樣品中沒食子酸的含量。

2.2.5 線性關系的考察 精密量取對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置25mL 棕色量瓶中，用孔徑0.45μm濾膜濾過，進針上樣。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得回歸方程Y=28 574X-51 114，r=0.999 7，沒食子酸在 10.32 ～103.20μg線性關系良好。

2.2.6 方法學考察 精密度實驗:在“2.2.1”項條件下，精密吸取沒食子酸對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，峰面積的RSD=1.8%，表明儀器精密度良好。

重復性實驗:精密稱取干燥沒食子，按“2.2.3”項下方法制備6份供試品溶液，分別測定沒食子酸的含量，RSD=1.6%(n=6)，證明此方法精密度良好。

穩(wěn)定性實驗:取室溫下放置的樣品溶液，在15 h內進樣6次，其峰面積的RSD=1.9%，表明樣品溶液在室溫下15 h穩(wěn)定。

加樣回收率實驗:取已知含量的樣品5份，每份約20 mg，分別精密加入沒食子酸對照品溶液(濃度為0.05 mg·mL-1)10 mL，超純水溶解定容至25 mL棕色量瓶中即得。分別進樣10μL，測定，計算平均回收率為101.76%，RSD為1.9%(n=5)。

2.3 不同提取方法提取沒食子鞣質對小鼠免疫功能的作用

2.3.1 對小鼠淋巴細胞增殖的影響 脾細胞懸液制備［9］:在無菌條件下取小鼠脾臟，用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈，然后放在細胞過濾篩上，用塑料注射器芯研碎脾臟，培養(yǎng)液沖洗獲取單細胞懸液。制備好后用培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度為(1～5)×106個·mL-1。

淋巴細胞增殖反應［10］:將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，再在各孔中加入不同濃度藥物100μL，每個濃度做5個平行，對照組加培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66 h后，取出，根據(jù)噻唑藍比色法測定生存細胞活性，在培養(yǎng)結束前4～6 h，向每孔中加入5 mg·mL-1噻唑藍溶液10μL，繼續(xù)孵育4 h，離心(1 000 r·min-1，r=15 cm，10min)后，輕輕吸棄上清液，加入二甲亞砜溶液100μL，稍震蕩，用酶標儀于波長570 nm處測定吸光度(A)值。

對刀豆蛋白(concanavalin A，ConA)誘導的淋巴細胞增殖反應:將細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，再在各孔中加入100μL不同濃度藥物，每個濃度做5個平行，最后加Con A溶液20μL，溶劑對照組為培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66 h后，取出，根據(jù)噻唑藍比色法測定存活細胞活性。

2.3.2 沒食子鞣質對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 小鼠腹腔巨噬細胞的制備參照文獻［10］，制備好的細胞用培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度至3×106個·mL-1。再以每孔100μL細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。棄上清液，用培養(yǎng)液洗去未貼壁細胞，培養(yǎng)孔內為腹腔巨噬細胞。每孔加培養(yǎng)液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)。按下列分組加樣，空白對照組加培養(yǎng)液100μL，加藥組加100μL(終質量濃度為100，50，25 μg·mL-1)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，棄上清液，加 0.075%中性紅溶液，每孔 100μL，培養(yǎng)30 min后，以磷酸鹽緩沖溶液洗3次，加醋酸-乙醇(1∶1)細胞溶解液，每孔100μL，于4℃靜置過夜，用酶標儀在570 nm波長處測A值。

3 結果

3.1 不同提取方法對沒食子鞣質提取效果的影響用HPLC方法測定提取物中沒食子酸提取率，結果見表1。從表1可以看出，70%甲醇超聲提取沒食子酸提取率最高，對沒食子鞣質的提取效果最佳。

表1 不同提取方法樣品沒食子酸含量測定和提取率結果Tab．1 The content determ ination and extraction rate of gallic acids in samples by different technology%± s，n=3

表1 不同提取方法樣品沒食子酸含量測定和提取率結果Tab．1 The content determ ination and extraction rate of gallic acids in samples by different technology%± s，n=3

提取方法 溶劑 水解后沒食子酸含量沒食子酸提取率浸泡 水22.23±1.77 62.24±2.12浸泡 80%丙酮 21.82±1.93 61.43±2.65超聲 70%甲醇 27.32±2.05 77.01±2.97攪拌 50%乙醇23.76±2.10 66.95±2.17

原藥材水解后沒食子酸平均含量為35.47%，沒食子酸的提取率(%)=提取出的沒食子酸含量/藥材水解后沒食子酸的含量×100%。

3.2 不同提取方法提取沒食子鞣質對小鼠免疫細胞的作用

3.2.1 對小鼠淋巴細胞增殖的影響 見表2?？芍?，沒食子鞣質對小鼠的脾淋巴細胞轉化A差值均大于空白對照組，水浸泡提取物、甲醇超聲提取物和乙醇攪拌提取物經萃取得到的沒食子鞣質濃度為20μg·mL-1時均能不同程度地增強小鼠脾淋巴細胞增殖反應，丙酮浸泡提取物萃取得到的沒食子鞣質濃度在40μg·mL-1增強了小鼠的脾淋巴細胞增殖反應。

3.2.2 對ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖的影響見表3?？芍?，沒食子鞣質對ConA誘導小鼠的脾淋巴細胞增殖具有促進作用，4種提取物濃度在所試范圍內均能不同程度地增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應，乙醇攪拌提取物和丙酮浸泡提取物萃取得到的沒食子鞣質濃度在40μg·mL-1就能明顯增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應。

3.2.3 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 采用小鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)吞噬中性紅實驗，結果見表4?？梢姴煌崛》椒ㄌ崛]食子鞣質在4.7～18.8μg·mL-1的質量濃度范圍內均能明顯增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力，但吞噬細胞的吞噬功能各組間差異均不顯著。

4 討論

沒食子有效成分主要是鞣質類的成分，沒食子鞣質是復雜多元酚類的混合物，相對分子質量較大，極性強，性質較為活潑，在提純過程中，容易發(fā)生氧化、水解等化學反應。鞣質通常用極性溶劑進行提取，為了減少雜質，多采用不加熱的提取方法。筆者采用該法測定總鞣質的含量，與經典的鞣質含量測定方法相比，HPLC法為鞣質定量分析開辟新的前景，鞣質在酸性條件下水解為沒食子酸，以沒食子酸含量為指標檢測鞣質含量，結果準確有效、重復性好。

表2 不同工藝沒食子鞣質對小鼠淋巴細胞增殖的影響(A值)Tab．2 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation(A)±s

表2 不同工藝沒食子鞣質對小鼠淋巴細胞增殖的影響(A值)Tab．2 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation(A)±s

與對照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取沒食子鞣質組 20 0.329 ±0.037*1 0.276±0.025*1 0.246±0.020 0.310 ±0.030*1 40 0.337 ±0.034*1 0.348±0.034*1 0.321±0.062*1 0.337 ±0.034*1 80 0.397 ±0.061*2 0.341±0.040*2 0.370±0.037*2 0.352 ±0.039*2對照組 0 0.275±0.028 0.223±0.021 0.240±0.016 0.205±0.038

表3 不同工藝沒食子鞣質對ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖的影響(A值)Tab．3 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation induced by ConA(A)±s

表3 不同工藝沒食子鞣質對ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖的影響(A值)Tab．3 Effects of gallotannins extracted by different technology on mouse lymphocyte proliferation induced by ConA(A)±s

與對照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取沒食子鞣質組 20 0.283±0.027 0.235±0.020 0.216±0.032 0.266±0.051 40 0.291±0.030 0.242±0.044 0.276±0.042*1 0.297 ±0.030*1 80 0.317±0.039*2 0.283±0.022*2 0.316 ±0.031*2 0.349 ±0.038*2對照組 0 0.258±0.041 0.223±0.022 0.219±0.030 0.248±0.033

表4 不同工藝沒食子鞣質對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(A值)Tab．4 Effects of gallotannins extracted by different technology on phagocytosis ofmouse peritonealmacrophages(A)±s

表4 不同工藝沒食子鞣質對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(A值)Tab．4 Effects of gallotannins extracted by different technology on phagocytosis ofmouse peritonealmacrophages(A)±s

與對照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 劑量/(μg·mL-1)水提取 甲醇提取 乙醇提取 丙酮提取沒食子鞣質組 4.7 0.158±0.023 0.163±0.034 0.133±0.029 0.137±0.032 9.4 0.184±0.034*1 0.193±0.034*1 0.137±0.024 0.203±0.052*1 18.8 0.226±0.041*2 0.232±0.012*2 0.172±0.025*2 0.220±0.017*2對照組 0.0 0.133±0.011 0.136±0.013 0.102±0.030 0.147±0.011

免疫增強藥物可能在機體免疫過程的不同環(huán)節(jié)起作用，文獻報道沒食子鞣質類可以增強機體非特異性免疫功能。篩選研究影響免疫功能的藥物時，影響免疫功能的研究方法較為復雜，近年來進展也較快。筆者采用體外方法檢測淋巴細胞增殖實驗，結果表明，沒食子鞣質有協(xié)同ConA誘導脾淋巴細胞增殖作用。實驗表明沒食子鞣質也能促進無絲裂原刺激的脾淋巴細胞增殖，說明沒食子鞣質本身就可以啟動淋巴細胞表面受體活化，具有絲裂原的刺激作用。該方法雖然不能反映淋巴細胞的全部功能，但可代表影響淋巴細胞活化的事實。以小鼠腹腔巨噬細胞在體外吞噬中性紅為指標，發(fā)現(xiàn)不同提取方法提取沒食子鞣質可使小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能明顯增加。本研究提示，沒食子鞣質能顯著增強小鼠特異性免疫和非特異性免疫功能，但能否全面增強機體免疫功能還有待進一步研究。

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