黃瑞英

廣西桂平市中醫(yī)院檢驗科 537200

新生兒溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN)主要是指母嬰血型不合、紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷、丙酮酸激酶缺乏、地中海貧血、球形紅細胞增多癥而產(chǎn)生同族血型免疫反應(yīng)的遺傳性疾病。當胎兒從父親繼承的紅細胞抗原恰為母親所缺乏時,胎兒紅細胞作為一種異抗原通過“胎盤出血”進入母體后,刺激母體產(chǎn)生相應(yīng)的血型抗體,產(chǎn)生免疫抗體,通過胎盤絨毛膜進入胎兒血循環(huán)與胎兒紅細胞凝集、使之破壞而出現(xiàn)溶血,引起貧血、水腫、肝脾腫大,嚴重者發(fā)生核黃疸甚至造成新生兒死亡。目前已發(fā)現(xiàn)人類有26個血型系統(tǒng)、400多個血型。每個血型系統(tǒng)在遺傳上都是獨立的,并按孟德爾法則遺傳。引起新生兒溶血病以的ABO系統(tǒng)為最多,次為 Rh系統(tǒng),其他如 MN、Kell、Duffy系統(tǒng)等血型不合引起的本病較少見。新生兒溶血病嚴重危害新生兒健康,容易造成新生兒終身與疾病相伴,所以新生兒溶血病一直以來都受到婦幼醫(yī)療學(xué)界的重視,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,目前新生兒溶血病的檢測和臨床治療手段有了很大的進步,其痊愈率也在不斷上升,筆者對新生兒溶血病的發(fā)病原因、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查綜述如下。

1 新生兒溶血病的發(fā)病原因

1.1 Rh血型不合 Rh血型不合引起的新生兒溶血癥在我國的發(fā)病率較低。通常是母親為Rh陰性,胎兒為Rh陽性而血型不合,并引起溶血,一般第一胎不發(fā)病,而從第二胎起發(fā)病,但如果Rh陰性的母親在第一胎前曾接受過Rh陽性的輸血,則第一胎也可發(fā)病。

1.2 ABO血型不合 本病以ABO血型不合最常見,其中最多見的是母親為O型,胎兒(或嬰兒)為A型或B型。第一胎即可發(fā)病,分娩次數(shù)越多,發(fā)病率越高,且一次比一次嚴重。尚可見于母親為A型,胎兒(或嬰兒)為B型或 AB型,母親為B型,胎兒(或嬰兒)＞為B型或AB型,但少見。胎兒(或嬰兒)為O型者,可排除本病。當然,不是所有母嬰血型不合的條件都會發(fā)生溶血,這和胎盤的致密程度、抗體的數(shù)量等多種因素有關(guān)。Rh血型不合溶血多發(fā)生在第二胎,或孕婦以前接受過輸血。這種情況下胎兒多在宮內(nèi)即發(fā)生了溶血,因此生后黃疸出現(xiàn)較早,進展快,而且多伴有貧血、水腫、肝脾增大;而ABO血型不合第一胎即可發(fā)病,但病情與Rh溶血相比較輕,病情發(fā)展也相對緩慢[1]。

2 新生兒溶血病的臨床表現(xiàn)

2.1 胎兒水腫 嚴重者表現(xiàn)為胎兒水腫,主要發(fā)生在Rh溶血病,在胎兒期有大量紅細胞破壞,患兒全身水腫、蒼白、皮膚淤斑、胸腔積液、腹水、心音低、心率快、呼吸困難、肝脾腫大。胎盤也明顯水腫,胎盤重量與新生兒體重之比可達1∶(3～4),嚴重者可發(fā)生死胎。

2.2 黃疸 溶血病患兒黃疸出現(xiàn)早,一般在生后24h內(nèi)出現(xiàn)黃疸,并很快發(fā)展,血清膽紅素以未結(jié)合膽紅素為主。但也有少數(shù)患兒在病程恢復(fù)期結(jié)合膽紅素明顯升高,出現(xiàn)膽汁黏稠綜合征。部分ABO溶血病黃疸較輕,與生理性黃疸相似。

2.3 貧血 溶血病患兒有不同程度的貧血,以Rh溶血病較為明顯。如血型抗體持續(xù)存在可導(dǎo)致溶血繼續(xù)發(fā)生,患兒在生后3～5周發(fā)生明顯貧血(Hb＜80g/L),稱晚期貧血,多見于未換血者和已接受換血的早產(chǎn)兒中。

2.4 肝、脾腫大 嚴重病例因髓外造血,出現(xiàn)肝、脾腫大。

2.5 膽紅素腦病(bilirubin cerebritis) 新生兒溶血病可發(fā)生膽紅素腦病,足月兒膽紅素超過18mg/dl,早產(chǎn)兒膽紅素超過12～15mg/dl就要警惕發(fā)生該病。開始表現(xiàn)為神萎、吸吮反射和擁抱反射減弱、肌張力低下,12h～1d,如病情進展,出現(xiàn)發(fā)熱、兩眼凝視、肌張力增高、抽搐、角弓反張等,可因呼吸衰竭或肺出血死亡。

3 實驗室檢查

3.1 ABO血型及Rh血型鑒定

3.1.1 ABO血型正反定型:根據(jù)紅細胞膜表面有無A抗原和(或)B抗原,將血型分為A型、B型、AB型及O型4種,可利用凝集試驗,通過正反定型準確鑒定ABO血型。所謂正定型是指用標準抗A和抗B分型血清來測定紅細胞上有無相應(yīng)的A抗原或(和)B抗原;所謂反定型是指用標準A型紅細胞和B型紅細胞來測定血清中有無相應(yīng)的抗A和(或)抗B?？刹捎貌捎貌Ｆɑ蛟嚬芊ㄟM行鑒定。

3.1.2 Rh血型鑒定:從理論上講人類紅細胞上的Rh抗原應(yīng)有 C 、c、D、d、E 、e 6種 ,但目前尚未發(fā)現(xiàn)抗d,因此也未肯定抗原,Rh抗原主要有5種。Rh血型形成的天然性抗體極少,主要是免疫性抗體,已知有抗 D 、抗E 、抗C、抗 c、抗e抗體等5種?？?D抗體是Rh血型系統(tǒng)中最常見的抗體。Rh抗體有完全抗體和不完全抗體兩種,完全抗體在機體受抗原刺激初期出現(xiàn),一般屬于IgM型。機體再次受抗原刺激,則產(chǎn)生不完全抗體,屬于IgG型。Rh抗體主要是不完全抗體,如用5種不完全抗體的血清(抗D 、抗E 、抗 C 、抗c、抗 e)做鑒定,可將 Rh血型系統(tǒng)分為18個型別。在臨床上,因D抗原的抗原性最強,出現(xiàn)頻率高,臨床意義又較大,故一般只做D抗原的血型鑒定。如僅用抗D血清進行鑒定,則凡帶有D抗原者稱為Rh陽性,不帶D抗原者稱為Rh陰性。

3.2 母親IgG抗體效價測定 胎盤對抗體的吸收是選擇性的,IgG是唯一能穿過胎盤的免疫球蛋白,并且IgG通過胎盤是一個主動轉(zhuǎn)運的過程,在妊娠24周時胎兒體內(nèi)的IgG濃度約為1.8g/L,足月時臍帶血中IgG水平可比母親高20%～30%,約為15.12g/L[2,3]。一般孕婦血清中IgG抗體效價的高低與胎兒受害程度呈正相關(guān)[4],因此,產(chǎn)前檢測孕婦血清中的IgG抗體效價對預(yù)防HDN的發(fā)生有重要的價值。胡雄燕[5]等認為:當母體IgG抗體效價≥1∶64時就有臨床意義,母體血清IgG抗體效價與新生兒溶血病的發(fā)生率成正相關(guān),動態(tài)監(jiān)測孕婦血清IgG抗體效價升高2個或2個以上滴度時,新生兒溶血病發(fā)生率可達73%。因此,當丈夫為非O型血的O型血孕婦,應(yīng)常規(guī)進行IgG抗體(抗A、抗B)效價檢測,在初次檢測到母體IgG抗體(抗A、抗B)效價較高時(≥1∶64),應(yīng)嚴密追蹤觀察,當抗體效價≥1∶256時,應(yīng)進行產(chǎn)前綜合治療[6],如靜脈注射免疫球蛋白。當然,有些特殊的病例當母體IgG抗體效價較高時卻沒有發(fā)生新生兒溶血病,一般認為可能與胎兒A、B抗原的強弱、胎盤的屏障作用強以及胎兒紅細胞上的致敏抗體的量和IgG亞群有關(guān)。IgG亞群中溶血性最強的是IgG3[7,8]。

3.3 IgG亞類的檢測 眾所周知IgG重要的生物學(xué)活性為特異性結(jié)合抗原,并通過重鏈C區(qū)介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng),包括激活補體、親和細胞而導(dǎo)致吞噬、胞外殺傷及免疫炎癥,最終達到排除外來抗原的目的,其中補體活化作用是關(guān)鍵的一步。IgG抗體有4個亞類 IgG1、IgG2、IgG3和 IgG4,各亞類與紅細胞結(jié)合后激活補體的能力順序為IgG1＞IgG3＞IgG2,當新生兒紅細胞上結(jié)合IgG2和IgG4時不發(fā)生溶血,只有結(jié)合IgG1和 IgG3時才發(fā)生溶血。IgG3和IgG1破壞紅細胞的能力不同,IgG3在介導(dǎo)單核細胞破壞抗體致敏紅細胞方面的能力比IgG1要強。在子宮內(nèi),IgG1抗-D引起HDN比IgG3抗-D更能導(dǎo)致嚴重的貧血,但它們進入胎兒血循環(huán)后,IgG3對紅細胞的破壞更為嚴重[9～14]。因此有必要進行母親產(chǎn)前血清IgG亞類檢測。

3.4 直接抗人球蛋白試驗(direct antiglobulin test,DAGT) 直接試驗應(yīng)用抗人球蛋白試劑(抗IgG和/或C3d)與紅細胞表面的IgG分子結(jié)合,如紅細胞表面存在自身抗體,出現(xiàn)凝聚反應(yīng),即產(chǎn)生新生兒同種免疫性溶血。趙建萍[15]等認為DAGT用于新生兒溶血病診斷敏感性較低,結(jié)合其他試驗進行診斷更可靠。

3.5 游離抗體試驗 新生兒血清中的IgG抗A(B)來自母親,因此,如果在新生兒血清中發(fā)現(xiàn)有與其紅細胞不配合的IgG抗A(B)時,表明嬰兒可能受害。將待測新生兒血清分別放入三支試管,分別加入5%A、B及O型紅細胞鹽水懸液1滴,37℃致敏1h后取出,若致敏后已發(fā)生凝集,說明存在相應(yīng)抗體。游離抗體檢測血中游離抗體用于判定是否存在繼續(xù)溶血,在治療效果的觀察和病情發(fā)展的評估上有實際意義。游離抗體要及時檢測,患兒出生時間越短檢測陽性率越高。出生0～4d檢測陽性率最高,這是因為在發(fā)病24h內(nèi)抽樣檢測,新生兒血液中還有較多的游離IgG血型抗體及致敏紅細胞存在的緣故,在發(fā)病24h后隨著發(fā)病時間的延長,檢測率越來越低,這是由于新生兒血液中只有少量的游離IgG血型抗體及致敏紅細胞存在,而大部分IgG血型抗體以游離的抗原抗體復(fù)合物的形式存在,失去了反應(yīng)原性[16]。

3.6 放散實驗 也稱釋放試驗,致敏的患兒紅細胞通過加熱將抗體放散于放散液中,然后再加入酶處理的成人相應(yīng)紅細胞致敏,紅細胞上的抗原與血清中抗體在適合條件下發(fā)生凝聚或致敏。這種結(jié)合是可逆的,如果改變某些物理條件時,抗體又可以從結(jié)合的細胞上解脫下來。這種方法稱為放散實驗。先利用特殊的方法將致敏在新生兒紅細胞上的抗體放散下來(ABO血型不合時加熱放散、Rh血型不合時乙醚放散),然后再檢測放散液中的抗體,當放散液中檢出抗體,同時新生兒紅細胞上又存在相應(yīng)抗原時,認為釋放試驗陽性。研究結(jié)果證實釋放試驗是“三項試驗”中敏感度最高,也是判定HDN最有力的證據(jù)[17]。

3.7 血清總膽汁酸(TBA)測定 血清總膽汁酸水平是唯一可同時反映肝臟分泌狀態(tài),肝臟合成與代謝及肝細胞損傷三方面的血清學(xué)指標。末梢血中TBA僅為1mg/L,當膽汁排出受阻或肝功能受損,血中TBA濃度很容易升高。結(jié)果顯示,在生理性黃疸患兒中TBA只有少數(shù)的增高,而病理性黃疸患兒的 TBA大多數(shù)增高。所以在治療中進行HDN患兒膽紅素監(jiān)測,很有必要對血清TBA進行測定,以指導(dǎo)臨床用藥及觀察療效[18]。

4 新生兒溶血病免疫血液學(xué)實驗室檢測方法

4.1 抗人球蛋白法 HDN的免疫血液學(xué)檢查主要是檢測母體針對胎兒的免疫性抗體IgG,包括檢測孕母體內(nèi)IgG型抗體效價及檢測新生兒紅細胞被IgG抗體致敏情況。采用試管抗人球蛋白法,較靈敏,結(jié)果可靠。

4.2 微柱凝膠技術(shù) 微柱凝膠抗人球蛋白試驗的原理是孕婦IgG類抗體致敏的紅細胞和微柱內(nèi)的抗人球蛋白結(jié)合而發(fā)生凝集,不能通過凝膠微粒間隙,離心后紅細胞不能達到微柱底部;而未被IgG類抗體致敏的紅細胞不與微柱內(nèi)的抗人球蛋白結(jié)合,離心后紅細胞通過凝膠微粒間隙達到微柱底部[19]。微柱凝膠技術(shù)是建立在傳統(tǒng)血型血清學(xué)基礎(chǔ)上的一項免疫學(xué)檢測技術(shù),將凝膠分子篩技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合,在離心力作用下抗原和抗體反應(yīng)后或抗體致敏凝集紅細胞留在微柱上端或分布在凝膠中,未凝集或未致敏紅細胞通過間隙到達微柱底部,形成不同強度的凝集反應(yīng)[20]。微柱凝膠抗人球蛋白試驗是一種新興的試驗方法,具有簡便、快速、省時、省力,結(jié)果易于觀察,反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定,易于保存,并可以拍照長期保存圖譜等優(yōu)點[21]。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法 通過檢測孕婦和新生兒體內(nèi)免疫性抗體IgG亞類判斷新生兒溶血程度越來越引起人們的關(guān)注,抗人球蛋白法只能檢測血液中總的IgG水平,檢測IgG亞類需要更為精確的方法,現(xiàn)階段國內(nèi)主要采用ELISA法[22]。ELISA法操作簡單,易于普及,但是存在一定的不足。首先影響ELISA法檢測的因素較多,酶標本身不穩(wěn)定,易受溫度和酸堿度變化的影響[23]。并且該方法是間接測量致敏紅細胞結(jié)合相關(guān)抗體的方法,為半定量法,定量欠精確。

4.4 單核單層檢測(monocyte monolayer assay,MMA) MMA是體外功能細胞實驗,是一類評估抗體臨床意義的試驗。MMA檢測方法是根據(jù)致敏紅細胞在體內(nèi)免疫反應(yīng)而設(shè)計的體外模擬實驗,在國外該檢測方法已作為臨床診斷新生兒溶血病一個常規(guī)輔助診療手段[24]。

4.5 流式細胞術(shù)(FACS) FACS是近年廣泛應(yīng)用的細胞自動分析分選技術(shù),它可以快速測量懸浮于液體中的分散細胞的一系列生物物理和生物化學(xué)特征性參量,并根據(jù)預(yù)定的參選范圍把指定的細胞亞群分選出來。FACS可以用于抗體致敏紅細胞的檢測,在IgG抗體經(jīng)試劑紅細胞吸附后,用于血液中IgG抗體的檢測[25,26]。由于每個熒光標記抗人IgG分子可帶有15～20個熒光基團,因此一個紅細胞只要結(jié)合幾個抗體分子,就足以被流式細胞儀檢出,極大地提高了試驗的靈敏度。

綜上所述,HDN主要由母嬰血型不合引起,隨著分子生物學(xué)不斷發(fā)展,并不斷應(yīng)用于臨床實踐,新生兒溶血病的檢查技術(shù)和方法也越來越多,如PCR技術(shù)也開始廣泛應(yīng)用于HDN的診斷,只有早檢查,及時診斷和治療,治愈率也較高,神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥也較少。

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