姚興存，李靜，舒留泉

（淮海工學院江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

條斑紫菜活性肽的制備及其功能性質研究

姚興存，李靜，舒留泉

（淮海工學院江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005）

采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解紫菜蛋白制備活性肽，以水解度為評價指標，優(yōu)化酶水解條件；研究條斑紫菜活性肽的溶解性、乳化性與乳化穩(wěn)定性、起泡性與泡沫穩(wěn)定性等功能性質。結果表明，3種酶解物都具有良好的溶解性且在等電點附近不沉淀，乳化性及其穩(wěn)定性不如紫菜蛋白且隨著pH升高而增強，酸性條件下起泡性較好，胰蛋白酶解物起泡性最強。

條斑紫菜；活性肽；水解條件；功能性質

條斑紫菜（Porphyra yezoensis）是長江以北江蘇沿海人工養(yǎng)殖的大型食用海藻。紫菜的主要成分有約50%的碳水化合物和30%的粗蛋白[1]，此外還含有豐富的維生素、礦物質及生物活性物質等。國內紫菜的主要利用途徑是作為干品直接食用，精深加工產品幾乎是空白。利用當地盛產的條斑紫菜，提取其中蛋白質，選取作用環(huán)境分別為酸性的胃蛋白酶、中性的木瓜蛋白酶、堿性的胰蛋白酶作為水解酶，將紫菜蛋白水解為生物活性肽，確定蛋白酶的最佳作用條件，研究紫菜活性肽的功能性質，以進一步開發(fā)紫菜保健食品，提高紫菜的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜為2010年3月連云港西墅物產有限公司生產的紫菜餅干品，凱氏定氮法[2]測定其蛋白質含量為33%。實驗室中將紫菜50℃烘干至恒重，粉碎機粉碎，100目過篩后超臨界CO2流體萃取脫除脂肪，儲于廣口瓶中干燥保存。

木瓜蛋白酶(酶活力為3×104U/g)、胰蛋白酶（酶活力為2.5×105U/g）、胃蛋白酶（酶活力為3×105U/g）購于上海生工有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）等化學試劑皆為國產分析純；玉米胚芽油購于連云港大潤發(fā)超市。

1.2 主要儀器

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Duo Flow層析系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Primo R多用途臺式高速冷凍離心機：美國熱電公司；Pro250精密勻漿器，美國Pro Scientific公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；FW-100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；KS-300超聲波粉碎機：寧波科生儀器廠；RE-501旋轉蒸發(fā)儀：南京金正科教儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫菜蛋白活性肽的制備

精確稱取一定量紫菜干粉，加100 mL水混合均勻，超聲輔助提取15 min，4000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL。將3份提取液分別調節(jié)pH至7.0、8.0、2.0，分別加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等3種蛋白酶，充分均勻后按各自的最佳水解條件分別進行酶解，每間隔20 min振蕩1次，酶解結束后，100℃滅酶10 min，自然冷卻后8000 r/min離心15 min，上清液即為紫菜蛋白酶解液（活性肽），冷藏備用。

1.3.2 蛋白質水解度的測定

式中：DH為蛋白質水解度，%；N1為水解液中總氨基態(tài)氮含量，（g/mL）；N2為樣品的總氮含量，（g/mL）。

水解液中總氨基態(tài)氮含量根據中性甲醛電位滴定法測定[2]，樣品總氮含量按凱氏定氮法測定[2]。

1.3.3 溶解性測定

測定方法依照參考文獻[3]。將酶解液濃縮4倍，取20 mL樣液，用HCl或NaOH溶液分別調pH 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，各取10 mL進行凱氏定氮[2]。另10 mL分別加入等體積的質量分數為10%三氯乙酸（TCA），混勻后放置30 min，5000 r/min離心15 min，取上清液進行凱氏定氮[2]，測可溶性氮含量，則樣品液三氯乙酸氮溶解指數（TCA-NSI）為：

1.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定為濁度法[4]。取3種酶解液和未酶解樣品液各21 mL，加入9 mL玉米油混合均勻，分別調pH至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，取3 mL室溫下14000 r/min均質1 min，分別在靜置0 min和30 min后從容器底部取0.03 mL乳狀液放入比色皿中，用3 mL質量分數為0.1%SDS溶液稀釋，500 nm處測吸光度，以SDS溶液空白調零。以靜置0 min后測出的OD值表示其乳化性，0 min和30 min后OD值的差值表示其相對乳化穩(wěn)定性。乳化性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）分別按下式計算：

式中：C為樣品濃度，（g/mL）；L為比色杯光徑，cm；A0為初始乳化液的吸光度；A30為30 min后的吸光度；Φ為乳化液中油相的比例；N為稀釋倍數；t為2次測定乳化性的時間間隔（這里t=30）。

1.3.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

測定方法依照參考文獻[5]。將酶解液濃縮10倍，取20 mL樣液，分別調pH2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，取6 mL用高速勻漿器10000 r/min攪打1 min，立即倒入量筒并記錄泡沫體積，靜置30 min后，再記錄其泡沫體積。起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）分別按下式計算：

式中：V0為攪打前的液體體積，mL；V1為攪打停止時的泡沫體積，mL；V2為攪打停止30 min后的泡沫體積，mL。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的水解條件研究

蛋白酶水解時受到溫度、水解時間、酶用量和酸堿度的影響最大。為此，根據單因素試驗結果，設計采用了L9（34）的正交試驗，研究因素間的交互作用。木瓜蛋白酶水解試驗的因素和水平如表1，表2為其正交試驗結果與極差分析。

表 1 木瓜蛋白酶水解正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of papayin hydrolysis

表 2 木瓜蛋白酶水解正交試驗結果與極差分析Table 2 Result and range analysis of the orthogonal test of papayin hydrolysis

由極差分析比較可以看出，因素對木瓜蛋白酶水解紫菜蛋白影響的主次順序是ACDB，即溫度對紫菜蛋白的水解度影響最大，其次是酶用量、酶解時間和pH。由此，確定水解各因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D3，即最佳水解條件為：水解溫度55℃，pH7.0，酶用量1%，水解時間為5 h。

在此條件下，進行3次驗證試驗，測得紫菜蛋白的水解度平均值為13.85%，說明最佳工藝條件下具有最大水解度。

同樣方法，正交試驗研究胃蛋白酶、胰蛋白酶的最佳水解條件，可以得到類似的結果，將3種酶水解紫菜蛋白優(yōu)化后的水解條件列于表3。

表 3 3種酶的適宜水解條件Table 3 The optimum hydrolyzing conditions of three kinds of enzymes

2.2 溶解性

不同pH條件下酶解液和未水解液的三氯乙酸氮溶解指數（TCA－NSI）見圖1。

由圖1可以看出，未酶解蛋白及酶解液在pH4～6時（等電點附近）溶解性皆較低；與未酶解蛋白相比，蛋白酶解液的溶解性顯著增大，這主要由于酶水解使得蛋白質的二級結構破壞，肽鏈長度變小，更小的分子和新暴露的離子化氨基與羧基提高了水解產物的親水性，從而增加了其溶解性。TCA-NSI指數也是蛋白質水解程度的重要指標。

2.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性

3種酶解液的乳化性測定結果如圖2所示，未進行酶水解的紫菜蛋白液的乳化性見圖3，酶解液和未水解液的乳化穩(wěn)定性見圖4。

由圖2和圖3可以看出，在研究的pH范圍內，未水解紫菜蛋白乳化性遠遠高于蛋白酶解物；隨著pH的升高，乳化性呈現明顯的上升趨勢，酸性環(huán)境中的乳化能力要弱于堿性環(huán)境；3種酶解液中，胰蛋白酶酶解液的乳化性最大，胃蛋白酶次之，木瓜蛋白酶最小。蛋白質與肽的乳化性與分子表面的親水、疏水基團及分子大小有關，酶法水解時，蛋白質被降解成短肽鏈，使大量的疏水性基團暴露并幾乎完全親水，則其乳化能力降低。另外，對于同一種蛋白酶解物，在不同pH下的乳化性有一定差別，隨著pH升高，其所帶負電荷增多，乳化性則有一定程度的增強。

從圖4乳化穩(wěn)定性的變化來看，在考查的pH范圍內，3種酶水解液和未水解液的乳化穩(wěn)定性均較小，在pH6時穩(wěn)定性最差。究其原因，一是由于紫菜蛋白的水解，酶解液中多為相對分子質量較小的肽，其乳化穩(wěn)定性降低；二是無論是原始蛋白質溶液還是酶解液的濃度均較低，即使能夠形成一定的乳化狀態(tài)也不會維持太長時間。

2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

3種酶解液和未水解液的起泡性見圖5，泡沫穩(wěn)定性見圖6。

根據圖5和圖6，蛋白酶解液和未酶解液在酸性條件下起泡性皆較好，但未發(fā)現兩者之間的明顯差異；蛋白質起泡性與分子表面基團的極性有關，隨著pH降低，極性基團增多，提高了表面疏水性，起泡性增強。在泡沫穩(wěn)定性方面，胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的泡沫穩(wěn)定性較好，木瓜蛋白酶酶解液的泡沫穩(wěn)定性較差；泡沫穩(wěn)定性在pH3～6的酸性環(huán)境下較差，隨著pH的升高，泡沫穩(wěn)定性增加，由于決定泡沫穩(wěn)定性的關鍵因素在于液膜的強度，而液膜強度主要取決于表面吸附膜的堅固性，當pH>6時表面活性較高，故泡沫穩(wěn)定性也高。

3 結論

通過實驗，確定了3種蛋白酶制備紫菜活性肽的適宜水解條件和制備工藝流程。

功能性研究結果表明，采用不同蛋白酶水解紫菜中的蛋白質，由于酶水解后，蛋白質被水解為短肽鏈，提高了紫菜蛋白的溶解性且在等電點附近不易沉淀，擴大了紫菜蛋白在食品工業(yè)中的應用范圍；紫菜蛋白質酶解物乳化活性隨著pH的升高而增強，但遠不及原始蛋白質；酶解物在酸性條件下起泡性較好，其中胰蛋白酶解物起泡性最強。

[1]姚興存，邱春江，穆春林.條斑紫菜營養(yǎng)成分與季節(jié)變化的研究[J].水產養(yǎng)殖，2002(5)：34-35

[2]張水華.食品分析實驗[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006：45-49

[3]陳升軍，熊華，李庭，等.米渣蛋白酶解及酶解物功能性質研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(5):114-118

[4]汪芳安，王慧溪，李永麗，等.米渣肽理化性質的研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30(10):127-130

[5]郭興鳳，馬維琦，張娟娟.酶法提取米渣中的蛋白質的功能性研究[J].河南工業(yè)大學學報：自然科學版，2009，30(10):4-8

Study on Preparation and Properties of Bioactive Oligopeptide from Porphyra yezoensis Proteins

YAO Xing-cun，LI Jing，SHU Liu-quan
（Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，Jiangsu，China）

In the research，Porphyra yezoensis proteins were hydrolyzed by papayin，trypsin and pepsin to prepare active peptides.The degree of hydrolysis was used as an index to optimize hydrolyzing conditions.Such properties as solubility，emulsibility，emulsion stability，foaming ability and foam stability of the peptides were also studied.The results showed that all of the three hydrolysates had good solubility and did not precipitate in the isoelectric point.The emulsibility and emulsion stability were not as good as Porphyra yezoensis proteins，and increased as pH rose.The foaming ability was good under the acidic condition，with trypsin hydrolysates the strongest.

Porphyra yezoensis；bioactive oligopeptide；hydrolyzing conditions；function properties

江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室開放課題（2008HS015）

姚興存（1963—），男（漢），副教授，本科，研究方向：海洋貝藻類精深加工與利用。

2011-03-13