王營 劉世育 費素娟 陳復興 劉軍權(quán)

·短篇論著·

γ-氨基丁酸、印防己毒素對γ δT細胞表面受體表達及對胰腺癌細胞殺傷力的影響

王營 劉世育 費素娟 陳復興 劉軍權(quán)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且廣泛存在于外周神經(jīng)組織及非神經(jīng)組織的細胞中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+和(或)CD8+T淋巴細胞上表達GABA的A受體，GABA與其結(jié)合能夠抑制抗原特異性T細胞活化，具有免疫抑制作用[2]。γ δT細胞是固有免疫的一個重要細胞群，廣泛分布于消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)上皮組織內(nèi),末梢血中也有一定的數(shù)量。γ δT細胞對多種腫瘤細胞系具有殺傷作用[3-4]。本實驗應用GABA及其A受體拮抗劑印防己毒素(picrotoxin,PTX)誘導人γ δT細胞，觀察誘導后γ δT細胞表面受體的表達和對SW1990細胞的殺傷力，探討其機制。

一、材料與方法

1．細胞的培養(yǎng)：取健康獻血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴細胞分離液，2000 r/min離心15 min，吸取單個核細胞層，生理鹽水洗滌3遍后加入RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清、5%人AB血清、IPP 3 ng/ml和IL-2 100 IU/ml)中常規(guī)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)10 d的γ δT細胞。人胰腺癌細胞株SW1990購于中國科學院上海細胞生物學研究所，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

2．流式細胞儀檢測表達表面受體γ δ-TCR和NKG2D的γ δT細胞：取培養(yǎng)10 d的γ δT細胞1×109個/L接種于96孔板,每孔0.2 ml 。培養(yǎng)24 h后分為200、800、3200 μmol/L GABA組，100 μmol/L PTX組和GABA(200 μmol/L)+PTX(100 μmol/L)組,每組分別加入熒光標記的抗人TCR -γδ-FITC單抗、抗人NKG2D-PE抗體(法國Immunotech公司)，終濃度為5 μg/ml,以不加抗體作為對照組，4℃避光孵育20 min,PBS液洗滌,然后用流式細胞儀檢測。

3．LDH法檢測γ δT細胞對SW1990細胞的殺傷率：將上述各組γ δT細胞與SW1990細胞數(shù)按10∶1比例混合作為測定管，同時設靶細胞自然釋放管(SW1990細胞+0.5%BSA-RPMI164)及最大釋放管(SW1990細胞+1%NP40),每組4個復管。常規(guī)孵育5 h后輕輕混勻細胞，再離心收集上清液，用Encore全自動生化分析儀測定LDH的活性單位(U/L)。γ δT細胞殺傷率=(測定管LDH單位-靶細胞自然釋放LDH單位)/(最大釋放管LDH單位-靶細胞自然釋放管LDH單位)×100%。

二、結(jié)果

1．GABA及PTX對γ δT細胞表面受體表達的影響：GABA呈濃度依賴性促進γ δT細胞表面γ δ-TCR表達，PTX亦促進γ δ-TCR表達，兩者聯(lián)合應用進一步促進γ δ-TCR表達(P<0.05)。200 μmol/L GABA促進γ δT細胞表面NKG2D的表達，但高濃度GABA抑制NKG2D表達，PTX亦抑制NKG2D表達，兩者聯(lián)合應用進一步抑制NKG2D表達。3200 μmol/L GABA組顯著增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達；PTX亦可增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達，但兩種聯(lián)合應用未進一步增加γ δ-TCR和NKG2D的雙表達(P值<0.05或0.01，表1)。

表1 各組表達表面受體γ δ-TCR、NKG2D的γ δT細胞百分比及對SW1990細胞的殺傷率

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.05

2．GABA及PTX對γ δT細胞殺傷SW1990細胞的影響：GABA誘導后，γ δT細胞對SW1990細胞的殺傷力明顯被抑制；PTX誘導后，γ δT細胞對SW1990細胞的殺傷力明顯增加，與GABA聯(lián)合應用，則可減輕GABA誘導所引起的抑制作用(P<0.05或<0.01，表1)。

討論γ δ-TCR和NKG2D是γ δT細胞表達的兩個主要與炎癥、腫瘤等免疫相關的受體。高表達CD44的γ δT細胞更容易與腫瘤細胞黏附,有效殺傷靶細胞,這與腫瘤細胞的γ δTCR刺激物和γ δT細胞的NKG2D受體表達水平密切相關[5]。本實驗結(jié)果表明，GABA及其A受體拮抗劑PTX均能促進γ δT細胞上γ δ-TCR的表達，降低NKG2D的表達，但γ δ-TCR和NKG2D雙表達細胞增加，提示它們促進γ δ-TCR表達的作用強于抑制NKG2D的表達，其機制有待于進一步研究。

研究表明[6]，在一定的效靶比時γ δT細胞體外對胰腺癌細胞有巨大的殺傷活性。本結(jié)果顯示，GABA可以抑制γ δT細胞對SW1990細胞的殺傷力，并呈劑量依賴性，與NKG2D表達降低程度呈正相關；而PTX可促進γ δT細胞對腫瘤細胞的殺傷力，提示γ δT細胞殺傷癌細胞主要是通過其表面受體NKG2D介導的。

[1] Watanabe M, Maemura K, Kanbara K,et al. GABA and GABA receptors in the central nervous system and other organs. Int Rev Cytol,2002, 213:1-47.

[2] Alam S, Laughton DL，Walding A, et al. Wolstenholme. Human peripheral blood mononuclear cells express GABAA receptor subunits. Mol Immunol，2006，43：1432-1442.

[3] 陳復興，劉軍權(quán)，馮霞，等.人末梢血γδT細胞對消化系統(tǒng)腫瘤細胞的殺傷作用.世界華人消化雜志,2007,15：111-116.

[4] Kabelitz D, Wesch D, He W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.Cancer Res,2007,67:5-8.

[5] Corvaisier M, Moreau Aubry A, Diez E,et al. V gamma 9V delta 2 T cell response to colon carcinoma cells. J Immunol,2005, 175: 5481-5488.

[6] 戴夢華, 何維, 趙玉沛. 外周血αβT和γδT細胞對胰腺癌細胞株的殺傷作用.中華肝膽外科雜志.2006, 12：440-443.

2010-09-15)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.022

徐州市科技局科技計劃項目(XZZD0818)

江蘇省徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科(王營、費素娟)；江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院消化科(劉世育)；中國人民解放軍第九七醫(yī)院實驗科(陳復興、劉軍權(quán))

王營，Email:wangyingxu20@21cn.com