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        沙利度胺對大鼠急性壞死性胰腺炎保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

        2011-11-22 01:07:16祝建紅陳衛(wèi)昌葉建新
        中華胰腺病雜志 2011年3期
        關(guān)鍵詞:血清檢測

        祝建紅 陳衛(wèi)昌 葉建新

        ·論著·

        沙利度胺對大鼠急性壞死性胰腺炎保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

        祝建紅 陳衛(wèi)昌 葉建新

        目的探討沙利度胺對大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)的保護(hù)作用及機(jī)制。方法54只SD大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分成ANP組、沙利度胺組和對照組,每組18只。采用5%?;悄懰徕c胰膽管逆行注射方法建立ANP模型。沙利度胺組于建模后1 h予沙利度胺200 mg/kg體重灌胃。術(shù)后3、6、12 h分批處死大鼠,觀察腹水量;ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-18水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞比例; RT-PCR法檢測胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá);免疫組化法檢測胰腺組織細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)蛋白表達(dá);行胰腺常規(guī)病理檢查。結(jié)果術(shù)后6 h,對照組的腹水量,血清TNF-α、IL-6、IL-18水平和CD4+、CD8+T細(xì)胞比例,胰腺組織TNF-α mRNA及CAM-1蛋白表達(dá),病理評分分別為(1.03±0.31)ml、(57.17±11.29)pg/ml、(24.45±4.14)pg/ml、(64.23±21.85)pg/ml、(47.58±9.21)%、(40.88±2.96)%、0.07±0.02、0.57±0.30、0.67±0.81;ANP組分別為(3.63±0.38)ml、(107.54±33.05)pg/ml、(47.30±11.40)pg/ml、(367.76±108.43)pg/ml、(54.90±7.15)%、(17.17±3.12)%、0.65±0.26、3.20±0.57、11.50±1.87;沙利度胺組分別為(1.45±0.53)ml、(80.60±20.48)pg/ml、(26.61±10.85)pg/ml、(321.82±85.20)pg/ml、(29.80±2.19)%、(15.52±1.96)%、0.35±0.23、2.37±0.67、8.00±3.03。ANP組除CD8+T細(xì)胞比例顯著降低外,其余指標(biāo)均較對照組顯著增加(P值均<0.05)。沙利度胺組指標(biāo)均顯著低于ANP組(P值均<0.05)。結(jié)論沙利度胺能通過抑制TNF-α表達(dá),減少炎癥遞質(zhì)的釋放,從而減輕ANP大鼠的胰腺病理損害。

        胰腺炎,急性壞死性; 腫瘤壞死因子α; 細(xì)胞間黏附分子; 大鼠; 沙利度胺

        近年來,炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子學(xué)說在重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視[1]。研究表明,急性胰腺炎(AP)本質(zhì)上是全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)[2]。TNF-α在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中處于始動地位,對細(xì)胞因子的級聯(lián)釋放具有重要意義,起到"扳機(jī)"樣作用,是評估SAP預(yù)后的主要指標(biāo)[3]。沙利度胺是谷氨酸衍生物,具有免疫調(diào)節(jié)、抑制TNF-α及非特異性抗炎作用,廣泛應(yīng)用于多種臨床免疫性疾病的治療[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察沙利度胺對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠的保護(hù)作用,探討其作用機(jī)制。

        材料及方法

        一、實(shí)驗(yàn)動物及分組

        健康SD大鼠54只,雌雄不限,清潔級,體重250~300 g,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。按數(shù)字表法隨機(jī)分為ANP組、沙利度胺組和對照組。采用膽胰管逆行注入4%?;悄懰徕c(Solarbio公司) 0.1 ml/100 g體重方法建立ANP模型。沙利度胺組于建模后1 h給予沙利度胺(25 g溶于500 ml橄欖油)200 mg/kg體重灌胃。對照組只開腹翻動胰腺后隨即關(guān)腹。術(shù)后3、6、12 h每組各處死6只大鼠。心臟穿刺取血。取胰腺組織,一部分常規(guī)固定,石蠟包埋;一部分液氮凍存。

        二、檢測指標(biāo)

        1.血清TNF-α、IL-6、IL-18檢測:新鮮血液經(jīng) 3500 r/min 4℃離心10 min分離血漿,-20℃保存。應(yīng)用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-18水平。試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司,按說明書操作。

        2.外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞檢測:取專用試管3支,加入大鼠外周血標(biāo)本100 μl,分別加入CD3-FITC/ICOS-PE、CD4-FITC/CD8-PE單克隆雙色抗體5 μl,充分混勻,室溫避光下孵育15 min,然后每管加入10×FACS(紅細(xì)胞裂解液)2 ml,充分混勻,室溫避光下溶血10 min至完全透明,1500 r/min離心10 min,棄上清液,PBS洗滌3次,每管加入0.5 ml PBS液懸浮,混勻放置室溫下,用美國Beckman公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀測定。

        3.腹水觀察:開腹后觀察腹水性質(zhì),用稱重的無菌紗布塞入大鼠腹腔約5 min,根據(jù)紗布重量的變化大體估算腹水量。

        4.胰腺組織的病理檢查:觀察胰腺組織大體病理變化后,石蠟包埋,常規(guī)切片、HE染色。由2位病理科醫(yī)師按Schmidt等[5]描述的組織學(xué)病理分級法盲法評分。

        5.胰腺組織TNF-αmRNA表達(dá)的檢測:用半定量RT-PCR法檢測。取液氮凍存胰腺組織,用Trizol(美國Invitrogen公司)試劑一步法抽提胰腺樣品總RNA。先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再PCR擴(kuò)增。TNF-α上游序列5′-CCAACAAGGAGGAGGAGAAGT-3′,下游序列5′-GTATGAAGTGGCAAATCG-3′,擴(kuò)增片段323 bp;內(nèi)參β-actin上游序列5′-CACGATGGAGGGGCC-GGACTCATC-3′,下游序列5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′,擴(kuò)增片段241 bp。PCR退火溫度54℃,38個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,掃描,以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值作為mRNA的表達(dá)量。

        6.胰腺組織細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)蛋白檢測:采用常規(guī)免疫組化染色法。以細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。隨機(jī)觀察5個具有代表性的高倍視野,計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比,<5%計0分, 5%~25%計1分, 26%~50%計2分,51%~75%計3分,>75%計4分。

        結(jié) 果

        一、血清TNF-α、IL-6、IL-18水平及外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群比例變化

        ANP組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-18水平均較對照組明顯升高;沙利度胺組大鼠血清TNF-α和IL-6水平于造模后6 h、IL-18水平于造模后12 h較ANP組明顯下降(P值均<0.05,表1)。

        ANP組CD4+T細(xì)胞比例在造模后3、6 h較對照組顯著增高,而12 h時顯著降低;CD8+T細(xì)胞比例在造模后6、12 h較對照組顯著下降(P值均<0.05)。沙利度胺組CD4+T細(xì)胞比例在6 h時較ANP組顯著下降,而在12 h時顯著增高;CD8+T細(xì)胞在12 h時顯著增高(P值均<0.05,表1)。

        表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-18水平及CD4+、CD8+ T細(xì)胞亞群比例

        注:與對照組比較,aP<0.05;與ANP組比較,bP<0.05

        二、腹水量及胰腺病理組織學(xué)改變

        對照組大鼠造模后3、6、12 h腹水量分別為(0.78±0.39)、(1.03±0.31)、(1.15±0.53)ml;ANP組分別為(2.33±0.66)、(3.63±0.38)、(5.43±1.53)ml,沙利度胺組分別為(1.78±0.45)、(1.45±0.53)、(1.53±0.60)ml。ANP組各時點(diǎn)均較對照組明顯增加(P值均<0.05);沙利度胺組6、12 h點(diǎn)較ANP組明顯減少(P值均<0.05),而與對照組無明顯差異。對照組大鼠胰腺無明顯病理學(xué)改變;ANP組大鼠胰腺組織大片出血壞死,小葉結(jié)構(gòu)破壞,大量炎細(xì)胞浸潤;沙利度胺組大鼠胰腺組織病理組織學(xué)改變較ANP組明顯減輕(圖1)。對照組、ANP組、沙利度胺組造模后6、12 h病理評分分別為0.67±0.82、11.50±1.87、8.00±3.03;0.50±0.55、12.00±3.23、8.23±3.25。三組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

        三、胰腺組織TNF-α mRNA及ICAM-1蛋白表達(dá)的變化

        ANP組各時間點(diǎn)大鼠胰腺組織TNF-αmRNA表達(dá)均較對照組明顯增高(P<0.05);沙利度胺組則較ANP組顯著降低(P值均<0.05,表2)。ANP組各時間點(diǎn)大鼠胰腺組織ICAM-1蛋白表達(dá)均較對照組明顯增高,而沙利度胺組6 h的ICAM-1蛋白表達(dá)較ANP組顯著降低(P值均<0.05,表2)。

        圖1對照組(a)、ANP組(b)、沙利度胺組(c)大鼠胰腺組織病理變化(HE ×100)

        組 別時點(diǎn)只數(shù)TNF-αmRNAICAM-1蛋白對照組3h60.05±0.020.47±0.35ANP組60.96±0.24a2.30±0.817a沙利度胺組60.31±0.15ab2.02±0.567a對照組6h60.07±0.020.57±0.294ANP組60.65±0.26a3.20±0.566a沙利度胺組60.35±0.23ab2.37±0.674ab對照組12h60.06±0.030.60±0.473ANP組60.30±0.23a2.60±0.748a沙利度胺組60.08±0.04b2.00±0.566a

        注:與對照組比較,aP<0.05;與ANP組比較,bP<0.05

        討 論

        TNF-α能作用于多種細(xì)胞,在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上激發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)[6]。IL-6是炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì),參與急性相反應(yīng)誘導(dǎo)ICAM-1和血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)的表達(dá),導(dǎo)致炎癥進(jìn)展,并且可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,使其通透性增加,導(dǎo)致大量炎性滲出。IL-6與TNF-α等協(xié)同,構(gòu)成炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ANP大鼠在造模后3 h血清TNF-α水平即顯著升高,胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)也明顯增高。同時,IL-6水平隨著時間的推移逐漸升高,表明TNF-α在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中處于始動地位,促進(jìn)炎癥細(xì)胞的遷移,并刺激靶細(xì)胞產(chǎn)生IL-6等炎癥因子,引起連鎖和放大反應(yīng)。

        Moreira等[7]報道,沙利度胺可抑制由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生,從而抑制炎癥反應(yīng)。給大鼠注射致死劑量的LPS前先給予該類似物,可明顯地抑制內(nèi)毒素性休克。本結(jié)果顯示,沙利度胺組在造模后3 h血清TNF-α水平即明顯降低,6 h后IL-6水平明顯降低,表明沙利度胺能抑制ANP時TNF-α的表達(dá),進(jìn)而降低IL-6分泌,從而緩解胰腺的局部炎癥反應(yīng)。

        IL-18是由庫否細(xì)胞及活化的巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生,能在內(nèi)毒素血癥時刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ[8]。Ueda等[9]研究表明,IL-18在AP并發(fā)多臟器功能衰竭的患者中顯著升高,阻斷IL-18是治療SAP并發(fā)多臟器功能衰竭的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沙利度胺組血清IL-18水平較ANP組下降,其中12 h時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。文獻(xiàn)報道,IL-18的表達(dá)和ICAM-1的表達(dá)具有相關(guān)性,并參與了SAP并發(fā)多臟器功能衰竭[10]。本結(jié)果也顯示沙利度胺治療后胰腺ICAM-1表達(dá)減少,提示沙利度胺不但能抑制胰腺局部的炎癥反應(yīng),還能通過抑制全身炎癥反應(yīng)減輕多臟器功能的損害。

        Ueda等[11]研究還發(fā)現(xiàn),SAP患者入院后14 d時的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量減低和繼發(fā)感染相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中,沙利度胺組12 h的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量均較ANP組增加,表明沙利度胺對AP時的免疫紊亂具有一定的調(diào)節(jié)作用,從而減少繼發(fā)感染的發(fā)生。

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        2010-05-12)

        (本文編輯:屠振興)

        Protectiveeffectsofthalidomideonratswithacutenecrotizingpancreatitis

        ZHUJian-hong,CHENWei-chang,YEJian-xin.

        DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalSoochowUniversity,Soochow215006,China

        Correspondingauthor:Chenwei-chang,Email:weichangchen@126.com

        ObjectiveTo investigate the protective effects of thalidomide on rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and its mechanism.MethodsFifty four SD rats were randomly divided into the three groups: ANP group, thalidomide group and control group with 18 rats in each group. The model of ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the bili-pancreatic duct. Rats in thalidomide group

        thalidomide 200 mg/kg body weight gastric lavage 1 h after ANP induction. The rats were sacrificed 3 h, 6 h, and 12 h after ANP induction, and the amount of intraperitoneal ascites was quantified. The serum levels of TNF-α, IL-6, IL-18 were measured by ELISA. The proportion of CD4+T cell, CD8+T cell in peripheral blood was determined by flow cytometry. The expression of TNF-α mRNA in pancreatic tissue were measured by RT-PCR.The expression of ICAM-1 protein in pancreatic tissue was measured by immunohistochemistry. Pancreatic tissue underwent pathologic examination.ResultsSix hours after surgery, the amount of ascite, serum levels of TNF-α, IL-6, IL-18, CD4+T cell, CD8+T cell, pancreatic TNF-α mRNA and ICAM-1 protein expression, pathologic score in control group was (1.03±0.31)ml, (57.17±11.29)pg/ml, (24.45±4.14)pg/ml, (64.23±21.85)pg/ml, (47.58±9.21)%, (40.88±2.96)%, 0.07±0.02, 0.57±0.30, 0.67±0.81, respectively, and the corresponding values were (3.63±0.38)ml, (107.54±33.05)pg/ml, (47.30±11.40)pg/ml, (367.76±108.43)pg/ml, (54.90±7.15)%, (17.17±3.12)%, 0.65±0.26, 3.20±0.57, 11.50±1.87 in ANP group; and (1.45±0.53)ml, (80.60±20.48)pg/ml,(26.61±10.85)pg/ml, (321.82±85.20)pg/ml, (29.80±2.19)%, (15.52±1.96)%, 0.35±0.23, 2.37±0.67, 8.00±3.03. Besides the value of CD8+T cell was significantly decreased, all other values were significantly increased when compared with control group (P<0.05).ConclusionsThalidomide can decrease the release of inflammatory mediator, and reduce the pathological damage of pancreas of ANP rats by inhibiting TNF-α mRNA expression.

        Pancreatitis,acute necrotizing; Tumor necrosis factor-alpha; Intercellular adhesion molecules; Rat; Thalidomide

        10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.018

        215006 江蘇蘇州 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科(祝建紅:現(xiàn)工作于常熟市第一人民醫(yī)院)

        陳衛(wèi)昌,Email:weichangchen@126.com

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