薛東波 呂明 路廣海 張偉輝 潘尚哈

·論著·

急性胰腺炎胰腺腺泡細胞不同死亡方式與細胞內(nèi)酶釋放的關(guān)系

薛東波 呂明 路廣海 張偉輝 潘尚哈

目的觀察輕重程度不同的體外急性胰腺炎(AP)胰腺腺泡細胞發(fā)生凋亡、脹亡的狀況及細胞內(nèi)酶的釋放情況，探討兩者的關(guān)系。方法以兩步酶消化法分離胰腺腺泡細胞，分為4組。AP組加入雨蛙素0.1 μg/ml，細菌脂多糖(LPS)組加入雨蛙素及LPS(10 mg/L)，奧曲肽(OCT)組加入雨蛙素及OCT(100 ng/ml)，對照組加培養(yǎng)液。應(yīng)用丫碇橙(AO)和溴乙錠(EB)雙染色法檢測腺泡細胞的凋亡及脹亡，采用比色法檢測培養(yǎng)上清中淀粉酶及乳酸脫氫酶(LDH)含量。結(jié)果對照組、AP組、LPS組、OCT組的細胞凋亡指數(shù)分別為2.2±0.4、6.4±0.6、4.6±0.4、11.2±1.2；脹亡指數(shù)分別為3.0±0.4、17.2±1.6、23.0±2.2、12.8±1.4；LDH的分泌量分別為(2180±240)、(8060±930)、(9460±920)、(6860±740)U/dl；淀粉酶的分泌量分別為(1750±190)、(3820±460)、(4420±480)、(2260±260)U/L。AP組、LPS組、OCT組的上述4項指標(biāo)均顯著高于對照組(P值均<0.05)；LPS組的脹亡指數(shù)及LDH和淀粉酶分泌量均較AP組顯著增加(P值均<0.05)，而凋亡指數(shù)則較AP組顯著減少(P<0.05)；OCT組的凋亡指數(shù)較AP組顯著增多(P<0.05)，而脹亡指數(shù)及LDH、淀粉酶分泌均較AP組顯著減少(P值均<0.05)。結(jié)論誘導(dǎo)AP胰腺腺泡細胞凋亡，并減少細胞脹亡的發(fā)生，可減少腺泡細胞內(nèi)酶的釋放。

胰腺炎； 細胞死亡； 細胞凋亡； 淀粉酶類

急性胰腺炎(AP)的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為，炎癥性細胞因子在其中起著重要作用，而受損的胰腺腺泡細胞所釋放的細胞內(nèi)酶及炎癥介質(zhì)等是此后細胞因子級鏈反應(yīng)的觸發(fā)劑，因此，如何抑制炎癥反應(yīng)的啟動成為減輕AP病變的關(guān)鍵。已知胰腺腺泡細胞內(nèi)容物的釋放是影響炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素，那么，影響胰腺腺泡細胞內(nèi)容物釋放的因素又是什么呢？本研究以不同藥物制備輕重程度不同的AP模型，通過離體實驗觀察胰腺腺泡細胞凋亡、脹亡狀況及細胞內(nèi)酶的釋放情況。

材料與方法

一、胰腺腺泡細胞的分離及分組

取體重(200±20)g雄性Wistar大鼠(清潔級，黑龍江省藥品檢驗所提供)的胰腺組織，剪碎至1.0 mm3大小，浸于消化液[10 mmol/L HEPES(Amresco, USA)、0.5 mg/ml膠原酶V(Sigma,USA),0.5 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(Amresco, USA),Eagle′s MEM (Gibco, USA)林格液]中，37℃水浴振蕩孵育20 min，同時充以純氧。更換消化液后再次消化20 min，用250 μm不銹鋼網(wǎng)過濾，HEPES-林格液洗滌，200×g離心3 min，共2次。將沉淀的腺泡細胞混懸于培養(yǎng)液中(以10%FBS代替膠原酶V,余同消化液)培養(yǎng)2 h，鏡下觀察。

調(diào)整細胞密度為1×105/ml個，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔 2 ml。AP組加入終濃度為0.1 μg/ml的雨蛙素(Sigma，USA)；細菌脂多糖(LPS)組加入終濃度為10 mg/L的LPS(Sigma，USA)及雨蛙素(0.1 μg/ml)；奧曲肽(OCT)組加入終濃度為100 ng/ml的OCT(Novartis，Swiss)及雨蛙素(0.1 μg/ml)；對照組加入等量培養(yǎng)液。每組設(shè)5個復(fù)孔。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，分別收集腺泡細胞及培養(yǎng)上清液。

二、細胞凋亡與細胞脹亡的檢測

收集各組胰腺腺泡細胞，分別采用丫碇橙(AO，10 μg/ml，Sigma，USA)和溴乙錠(EB，10 μg/ml，Sigma，USA)染色10 min。甩片后在熒光顯微鏡(Nikon, Japan)下計數(shù)500個細胞，計算凋亡指數(shù)及脹亡指數(shù)。

三、培養(yǎng)上清中淀粉酶及乳酸脫氫酶(LDH)檢測

分別離心收集各組培養(yǎng)上清液，應(yīng)用胰淀粉酶檢測試劑盒及LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測淀粉酶及LDH含量，按說明書操作。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺腺泡細胞的死亡方式

AO染色后，正常細胞胞核被綠染，形態(tài)正常；凋亡細胞胞核也被綠染，但核皺縮、濃集、分裂。EB染色后，正常及凋亡細胞的完整細胞膜拒染；脹亡細胞的胞核被染為桔紅色(圖1)。對照組、AP組、LPS組、OCT組的細胞凋亡指數(shù)分別為2.2±0.4、6.4±0.6、4.6±0.4、11.2±1.2；脹亡指數(shù)分別為3.0±0.4、17.2±1.6、23.0±2.2、12.8±1.4。AP組、LPS組、OCT組細胞的凋亡指數(shù)及脹亡指數(shù)均顯著高于對照組(P值均<0.05)；LPS組的脹亡細胞數(shù)較AP組顯著增多(P<0.05)，而凋亡細胞數(shù)則顯著減少(P<0.05)；OCT組的凋亡細胞數(shù)較AP組顯著增多(P<0.05)，而脹亡細胞數(shù)則顯著減少(P<0.05)。

二、離體胰腺腺泡細胞LDH及淀粉酶的分泌量

對照組、AP組、LPS組、OCT組細胞LDH的分泌量分別為(2180±240)、(8060±930)、(9460±920)、(6860±740)U/dl；淀粉酶的分泌量分別為(1750±190)、(3820±460)、(4420±480)、(2260±260)U/L。AP組細胞LDH及淀粉酶的分泌量顯著高于對照組(P值均<0.05)；LPS組細胞LDH及淀粉酶的分泌量又顯著高于AP組(P值均<0.05)；而OCT組細胞的LDH及淀粉酶分泌量均顯著低于AP組(P值均<0.05)。

圖1脹亡(紅箭頭)和凋亡(綠箭頭)的胰腺腺泡細胞(AO和EB雙染色 ×40)

討 論

凋亡和脹亡代表了兩種不同的細胞死亡方式[1]。自從1972年Kerr提出細胞凋亡的概念以來，學(xué)術(shù)界對細胞凋亡進行了較深入的研究。近幾年人們才開始關(guān)注脹亡，并逐漸認(rèn)識到脹亡的意義并不亞于凋亡。細胞脹亡是細胞腫脹，細胞膜完整性破壞，DNA裂解為非特異性片段，最后細胞溶解并伴有炎癥反應(yīng)的細胞死亡過程。在某些生理或病理過程中，兩種死亡方式同時存在，并在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)換。Andersson等[2]認(rèn)為，AP時細胞脹亡的發(fā)生和程度決定了AP的病變嚴(yán)重程度。腺泡細胞若以脹亡方式死亡則會釋放各種胰酶、炎癥介質(zhì),并由此引起多種炎癥細胞聚集，誘發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)；若以凋亡方式死亡，因為細胞膜保持完整，不伴炎癥介質(zhì)、胰酶釋放，故炎癥反應(yīng)較輕[3]。因此，如果我們能夠誘導(dǎo)AP時的胰腺腺泡細胞發(fā)生凋亡，并減少脹亡，則有可能抑制超強炎癥反應(yīng)的啟動及其引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多器官功能不全綜合征(MODS)。

LPS(又稱為脂多糖)是革蘭陰性桿菌(G-)外膜的主要成分。有研究表明，腸源性內(nèi)毒素血癥可以促使急性水腫型胰腺炎向急性壞死型胰腺炎發(fā)展[4]，其可能的作用機制是內(nèi)毒素上調(diào)細胞黏附分子，促進中性粒細胞大量聚集，并釋放許多細胞因子造成組織損傷。OCT是人工合成的生長抑素八肽，被廣泛用于AP的治療[5]，其主要作用是抑制胰酶分泌，但近來人們發(fā)現(xiàn)其有誘導(dǎo)胰腺腺泡細胞凋亡的作用[6-7]。本實驗采用雨蛙肽制備體外AP模型。在此基礎(chǔ)上，再以LPS刺激制備重度AP模型，以O(shè)CT刺激制備輕度AP模型。結(jié)果顯示，以雨蛙肽刺激制備的AP模型用LPS處理后，凋亡細胞數(shù)減少，脹亡細胞數(shù)增加；而用OCT處理后，凋亡細胞數(shù)增加，脹亡細胞數(shù)減少。

脹亡細胞由于存在細胞膜缺陷，細胞內(nèi)物質(zhì)可釋放到細胞外；正常及凋亡細胞由于細胞膜完整，無此現(xiàn)象[8]。本實驗結(jié)果顯示，以雨蛙肽刺激制備的AP模型的腺泡細胞用LPS處理后LDH及淀粉酶釋放量增高；而用OCT處理后LDH及胰淀粉酶釋放量明顯下降，表明誘導(dǎo)凋亡、抑制脹亡后，減少了細胞內(nèi)酶的釋放。故抑制細胞脹亡、誘導(dǎo)細胞凋亡可能成為治療AP的新的思路。

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2010-10-15)

(本文編輯：屠振興)

ObjectiveTo observe the apoptosis or oncosis of pancreatic acinar cells of different severity of acute pancreatitis (AP) and the release level of enzymes in vitro, and to investigate the relationship between them.MethodsTwo-step enzymatic digestion method was used to separate pancreatic acinar cells into 4 groups. 0.1 μg/ml of the caerulein was added in the AP group. Caerulein and LPS (bacterial lipopolysaccharide, 10 mg/L) were added in LPS group. Caerulein and OCT (octreotide, 100 ng/ml) were added in OCT group. Medium was added in the control group. AO (acridine orange) and EB (ethidium bromide) double staining method was used to detect the incidence of apoptosis or oncosis of acinar cell. The release of intracellular enzyme was detected by measuring the concentrations of amylase and LDH in cell culture media by colorimetry method.ResultsThe apoptosis index was 2.2±0.4, 6.4±0.6, 4.6±0.4, 11.2±1.2 in the control group, AP group, LPS group, OCT group; while the oncosis index was 3.0±0.4, 17.2±1.6, 23.0±2.2, 12.8±1.4 in the control group, AP group, LPS group, OCT group; the release of LDH was (2180±240), (8060±930), (9460±920), (6860±740)U/dl, the level of amylase was (1750±190), (3820±460), (4420±480), (2260±260)U/L. All the values in the experiment groups were significantly higher than that in control group (P<0.05). The oncosis index, LDH, amylase in LPS group was significantly higher than that in AP group (P<0.05), but the apoptosis index in LPS group was significantly lower than that in AP group (P<0.05). The apoptosis index in OCT group was significantly higher than that in AP group (P<0.05), but the oncosis index, LDH, amylase was significantly lower than that in AP group (P<0.05).ConclusionsInduction of apoptosis and reduction of oncosis in AP pancreatic acinar cells can reduce the release of enzyme in acinar cells.

Pancreatitis; Cell death; Apoptosis; Amylases

RelationshipbetweendifferentdeathwaysofpancreaticacinarcellsandreleaseofintracellularenzymesinacutepancreatitisXUEDong-bo,LüMing,LUGuang-hai,ZHANGWei-hui，PANShang-ha.DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.016

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(11531157)

150001 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科(薛東波、路廣海、張偉輝、潘尚哈)；美國加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校David Geffen醫(yī)學(xué)院外科系(呂明)