張棟梁，孫皆紳，陳健康，鐵 茹，曲 萍，陳寶瑩 (第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)實驗中心，西安 7003;第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院放射科;通訊作者，E-mail:yujunby@fmmu.edu.cn)

NPs是一個結(jié)構(gòu)相似但基因不同的肽類家族，包括ANP、BNP和CNP。它們在維持心血管和腎臟的穩(wěn)態(tài)方面扮演著重要的角色［1］。ANP是一種由28個氨基酸構(gòu)成的肽，而BNP含32個氨基酸，CNP含22個，它們都具有一個由17個氨基酸組成、對于藥理作用所必需的環(huán)結(jié)構(gòu)［2］。NPs的藥理作用大多是通過與耦聯(lián)有鳥苷酸環(huán)化酶微粒的鈉尿肽受體(NPR-A或NPR-B)結(jié)合后，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cGMP水平的升高實現(xiàn)的。ANP和BNP主要與NPR-A結(jié)合，而CNP則主要與NPR-B結(jié)合［3］。

與ANP和BNP相比，CNP缺少C末端，導(dǎo)致其在促尿鈉排泄功能上的不足［4，5］。因此，盡管有擴(kuò)張靜脈上的優(yōu)勢，CNP在治療伴有水鈉潴留的疾病(如急性心衰)時還是受到了限制［5，6］。為了優(yōu)化NPs的結(jié)構(gòu)，我們采取的蛋白設(shè)計策略是:將一種肽類的獨特有效結(jié)構(gòu)與另一肽類的活性結(jié)構(gòu)進(jìn)行組合，合成一種同時具有兩個親代優(yōu)勢藥理作用的嵌合體［7］?；诖瞬呗?，我們設(shè)計合成了由CNP的環(huán)結(jié)構(gòu)和ANP的C－端、N－端所構(gòu)成的新鈉尿肽AC-NP，并對其藥理活性進(jìn)行評估。

1 材料和方法

1.1 材料 ANP、CNP、VNP和 AC-NP均由江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院提供。NE(去甲腎上腺素)和ACh(乙酰膽堿)系美國Sigma公司產(chǎn)品。［125I］－cGMP放射免疫試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學(xué)。

♂SD大鼠(體重250－350 g，6－8周齡)在室溫為(23±1)℃、相對濕度為60%－70%的環(huán)境下飼養(yǎng)，每天6:00至18:00給予光照。整個實驗階段，大鼠在標(biāo)準(zhǔn)的實驗室清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，并給予自由飲食飲水。

1.2 方法

1.2.1 AC-NP的設(shè)計 將具有6個氨基酸的ANP的C末端、5個氨基酸的ANP的N末端整合到具有17個氨基酸的CNP環(huán)結(jié)構(gòu)上，設(shè)計合成具有28個氨基酸的新型鈉尿肽AC-NP。

1.2.2 腹主動脈環(huán)制備和舒血管活性測定 正常SD大鼠5只經(jīng)腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，剪取腹主動脈，置于盛有冷的Krebs液(mmol/L:115 NaCl，4.7 KCl，25 NaHCO3，1.2 MgCl2，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2，10 glucose;pH 7.4)中，去掉血管表面結(jié)締組織，制備成3 mm長的血管環(huán)。其中一半血管環(huán)用浸有對照液的棉花拭子輕輕摩擦內(nèi)皮表面以去除內(nèi)皮。將血管環(huán)懸掛于盛有37℃ Krebs液的浴槽中，通入含95%O2和5%CO2的混合氣體［8］，連接張力傳感器。重復(fù)給予 0.1 mol/L KCl，以每次100 mg遞增直至找到最佳基礎(chǔ)張力為500 mg，用于后面的藥理學(xué)實驗。經(jīng)平衡30 min后，用ACh(10－6mol/L)對經(jīng)過 NE(10－6mol/L)預(yù)收縮的血管環(huán)是否產(chǎn)生舒張效應(yīng)判斷血管內(nèi)皮活性。然后反復(fù)沖洗使血管張力恢復(fù)至基線，穩(wěn)定30 min后重復(fù)給予NE(10－6mol/L)，使血管環(huán)收縮達(dá)穩(wěn)定值(80%最大收縮幅度)，分別逐漸增加ANP、CNP、VNP或 AC－NP的濃度(10－10－10－6mol/L)，以制作累積濃度－舒張反應(yīng)曲線，求出最大舒張反應(yīng)值(Emax)。

1.2.3 在體心腎活性測定 實驗大鼠分成5個組:ANP組、CNP組、VNP組、AC-NP組和生理鹽水對照組，每組6只。腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，按每小時1 ml/100 mg經(jīng)左頸靜脈輸注0.9%NaCl溶液，手術(shù)完成后穩(wěn)定30 min，接著給予15 min的基礎(chǔ)期。之后，各組分別靜脈推注0.1 ml NPs(ANP、CNP、VNP 或 AC-NP，50 μg/kg)或生理鹽水，緊接著依次是15 min的給藥期、30 min的清除期、15 min的恢復(fù)期。

在各個實驗階段，經(jīng)左頸動脈插管，采用BL-420F生物信號采集系統(tǒng)(成都泰盟公司)記錄平均動脈壓(mCAP)。在基礎(chǔ)期和給藥期的中間時間點取血于EDTA管中，離心(4℃，2 500 r/min)并分離上層血清，在－20℃條件下保存直至用于cGMP的測定。整個基礎(chǔ)期和給藥期收集尿液并加熱至90℃，保存直至用于尿量、尿鈉、尿cGMP水平的分析。尿鈉的測定采用塞曼原子吸收光譜分析法，血漿及尿cGMP水平通過前面提及的［125I］－cGMP檢測試劑盒進(jìn)行放射免疫測定［9］。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析，結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析法(ANOVA)，若存在差異，再用LSD法進(jìn)行多組樣本均數(shù)兩兩之間的比較。P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

新合成AC-NP結(jié)構(gòu)見圖1所示，含有28個氨基酸，包括來自CNP的17個氨基酸組成的環(huán)結(jié)構(gòu)和ANP的C末端及N末端。AC-NP和VNP都是ANP與CNP的嵌合體。從結(jié)構(gòu)上看，ANP與CNP是AC-NP的“雙親”，而VNP和AC-NP則是“兄弟”關(guān)系。考慮到四者結(jié)構(gòu)上的相似性，我們比較研究了AC-NP與ANP、CNP及VNP的藥理活性。

圖1 人ANP(h-ANP)、人CNP(h-CNP)、嵌合體 VNP及新型嵌合體AC-NP的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)Fig 1 Amino acid sequences and structures of human ANP(h-ANP)，human CNP(h-CNP)，chimeric VNP and novel chimeric AC-NP

2.1 離體腹主動脈舒血管活性 收縮反應(yīng)曲線結(jié)果顯示，在以10－6mol/L的NE預(yù)收縮后，AC-NP對腹主動脈環(huán)呈濃度依賴性的舒張作用，見圖2A。AC-NP對去內(nèi)皮和內(nèi)皮完整的血管環(huán)作用相當(dāng)(圖2B)，表明 AC-NP呈非內(nèi)皮依賴性的舒張作用。ANP、CNP、VNP、AC-NP 對腹主動脈環(huán)的最大舒張作用(圖2C)。相對于對照組，10－6mol/L的ANP、CNP、VNP、AC-NP均引起顯著的舒血管作用，舒張效力為CNP＞AC-NP＞VNP＞ANP，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A.NE預(yù)收縮后，AC-NP對腹主動脈環(huán)的舒張作用;B.AC-NP對去內(nèi)皮和內(nèi)皮完整的血管環(huán)的舒張作用(數(shù)據(jù)表示為AC-NP在由濃度為10－6mol/L的NE引起最大收縮反應(yīng)基礎(chǔ)上所引起的舒張百分比);C.ANP、CNP、VNP、AC-NP對腹主動脈環(huán)的最大舒張作用。與對照組比較，*P＜0.05

2.2 在體心腎活性 與離體實驗相同，相對于生理鹽水對照組，10－6mol/L 的 ANP、CNP、VNP、AC-NP均顯著降低大鼠mCAP(P＜0.05，n=6)，其降低百分比依次為24%，15%，29%，44%，表明AC-NP具有潛在的降血壓效應(yīng)(圖3)。

圖3 AC-NP降低平均頸動脈壓的作用Fig 3 Effect of AC-NP on mean carotid arterial pressure(mCAP)in rats

ANP、CNP、VNP、AC-NP 在正常大鼠的利尿利鈉作用見表1。除了 CNP無明顯作用外，ANP、VNP、AC-NP均顯著增加尿量和尿鈉排泄量(P＜0.05，n=6)，且 AC-NP 的作用最強(qiáng)，其利鈉利尿效力為AC-NP＞ANP＞VNP＞CNP。

表1 ANP、CNP、VNP及AC-NP對經(jīng)靜脈注射的大鼠尿量及尿鈉排泄水平的影響(±s，n=6)Tab 1 Effects of intravenous injection of AC-NP，ANP，CNP and VNP on urine volume and urine Na volume in anesthetized rats(±s，n=6)

表1 ANP、CNP、VNP及AC-NP對經(jīng)靜脈注射的大鼠尿量及尿鈉排泄水平的影響(±s，n=6)Tab 1 Effects of intravenous injection of AC-NP，ANP，CNP and VNP on urine volume and urine Na volume in anesthetized rats(±s，n=6)

與基礎(chǔ)期比較，*P＜0.05;與 ANP組、CNP組、VNP組比較，#P ＜0.05

組別 時間 尿量/(μl/min) 尿鈉/(μmol/min)ANP組 基礎(chǔ)期7.4 ±1.1 0.6 ±0.1給藥期 28.9 ±2.2* 2.6 ±0.4*CNP組 基礎(chǔ)期 7.8±0.9 0.8±0.2給藥期 7.4 ±0.8 0.8 ±0.1 VNP組 基礎(chǔ)期 8.7±1.2 0.9±0.2給藥期 19.2 ±1.8* 2.5 ±0.3*AC-NP組 基礎(chǔ)期 7.5±0.9 0.7±0.1給藥期 75.0 ±11.4*# 7.1 ±0.7*#

NPRA/B/cGMP/PKG是鈉尿肽家族參與對心血管及腎臟系統(tǒng)生物活性調(diào)節(jié)的傳統(tǒng)信號傳導(dǎo)通路［3］。因此，我們對鈉尿肽給藥前后大鼠尿液和血漿中cGMP的水平進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。與其他鈉尿肽相比，AC-NP對血漿cGMP水平的升高作用最強(qiáng)。對于尿cGMP的水平，AC-NP的升高作用也明顯強(qiáng)于 CNP、VNP(P＜0.05，n=6)。

圖4 ANP、CNP、VNP、AC-NP對血漿及尿cGMP水平的影響Fig 4 Responses of plasma cGMP levels(PcGMP)and urine cGMP excretion(UcGMP)to ANP，CNP，VNP and AC-NP

3 討論

本研究首次報道了ANP和CNP的新型嵌合體AC-NP的心血管活性和腎活性。該新型鈉尿肽包含CNP的17個氨基酸組成的環(huán)結(jié)構(gòu)及ANP的C末端和N末端。實驗證明，AC-NP為一強(qiáng)有力的舒血管肽，作用與ANP、CNP、VNP相當(dāng)。特別的是，相對于先前報道的 CNP 缺乏明顯的腎臟活性［5，6，10］，AC-NP具有顯著的利尿利鈉作用，且效力比ANP、VNP更強(qiáng)，其利尿作用可促進(jìn)降血壓作用。AC-NP顯著升高血漿及尿cGMP水平，且尿cGMP水平的升高作用比CNP、VNP更強(qiáng)。

199 3年，Wei等［11］將具有22個氨基酸的 CNP環(huán)結(jié)構(gòu)與ANP的C末端組合，設(shè)計合成了一種新型鈉尿肽嵌合體—VNP。其不僅具有CNP的擴(kuò)張靜脈和ANP的促尿鈉排泄作用，還具有與兩者無關(guān)的動脈血管舒張作用。此外，Lisy等［12］將DNP(dendroaspis natriuretic peptide)的C末端整合到CNP的結(jié)構(gòu)中，得到一種新型鈉尿肽－AD-NP。在體實驗證明，AD-NP具有利尿利鈉、提高腎小球濾過率、降低心臟負(fù)荷及抑制腎素的作用。然而，DNP是從樹眼鏡蛇體內(nèi)提取分離出來的，其非人類來源可能對其在人體的安全帶來潛在的危險。最近，Kilic等［13］報道了一種由CNP的環(huán)結(jié)構(gòu)和利尿鈉素(urodilatin，URO)的C末端、N末端嵌合而成、不具有血管舒張作用的鈉尿肽分子－CU-NP。CU-NP對暴露于苯腎上腺素的新生大鼠心室肌細(xì)胞具有直接的抗肥大作用。URO含32個氨基酸，是表達(dá)于腎臟的ANP選擇性拼接的產(chǎn)物［14］。受以往所報道的在合成鈉尿肽嵌合體方面的研究工作所啟發(fā)，我們設(shè)計合成了由CNP的環(huán)結(jié)構(gòu)和ANP的C－端、N－端所構(gòu)成的新鈉尿肽AC-NP，并對其藥理活性進(jìn)行了評估。

從結(jié)構(gòu)上看，ANP在環(huán)的C末端有氨基酸，而CNP在環(huán)的C末端沒有延伸于環(huán)外的氨基酸。ACNP與VNP一樣，均將ANP的C末端整合到CNP的環(huán)結(jié)構(gòu)上，而兩者在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是:前者N末端來自ANP，后者的N末端則來自CNP(圖1)。我們的研究(圖4)和之前的研究［11］均證明，將ANP的C末端整合到CNP的環(huán)結(jié)構(gòu)可獲得利尿利鈉功能。重要的是，在ANP末端和CNP環(huán)結(jié)構(gòu)上設(shè)計出的AC-NP證明C末端和N末端都是鈉尿肽生物活性的重要功能性結(jié)構(gòu)。因此，與母體ANP、CNP相比，嵌合體 AC-NP、VNP［11］及最近報道的 AD-NP［12］、CU-NP［13］具有功能上的優(yōu)勢。以上表明，設(shè)計合成新型鈉尿肽嵌合體，以優(yōu)化鈉尿肽結(jié)構(gòu)對于鈉尿肽的臨床應(yīng)用是可行的策略。

目前，我們只對AC-NP的心腎活性進(jìn)行檢測，而其作用機(jī)制還處于未知狀態(tài)。鑒于cGMP是NPs/NPR/cGMP/PKG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的經(jīng)典第二信使［3］，加上AC-NP具有提高血漿和尿cGMP水平的作用提示:cGMP參與了AC-NP的作用機(jī)制。由于ANP、BNP主要與NPR-A結(jié)合，而CNP則通過NPRB作用，作為ANP和CNP的嵌合體，AC-NP可能通過與NPR-A或NPR-B結(jié)合發(fā)揮藥理作用。據(jù)報道［15］，ANP和CNP的另一嵌合體VNP在腎小球和腎動脈通過NPR-A發(fā)揮藥理作用?？紤]到AC-NP與VNP的同源性，AC-NP更有可能通過NPR-A起作用。然而我們目前的研究未能排除NPR-B參與AC-NP的作用機(jī)制，這還有待于下一步研究證實。

綜上所述，作為新型人工合成的鈉尿肽，AC-NP在舒血管和利尿鈉作用上的優(yōu)勢提示它也許能夠在臨床上治療伴有水鈉潴留的心血管和腎臟疾病中發(fā)揮作用。

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