李 珂，郝 艷，王建亭，馬 敏 (長治市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，長治 06000;長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院耳鼻咽喉科;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉科;

*通訊作者，E-mail:tingjianwang@yahoo.com.cn)

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡及增殖調(diào)節(jié)的失控密切相關(guān)，其中細(xì)胞凋亡在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。促凋亡因子Omi/HtrA2對多種腫瘤細(xì)胞具有促凋亡效應(yīng)，caspase-7是位于凋亡下游的重要效應(yīng)蛋白，其在凋亡途徑中發(fā)揮的重要作用早已引起人們的關(guān)注。本研究通過觀察喉鱗狀細(xì)胞癌中Omi/HtrA2和caspase-7蛋白的表達(dá)以及二者與臨床病理特征相關(guān)性之間的關(guān)系，探討其與喉癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，為喉癌診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2003－06～2009－12山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院和長治市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科收治的有完整臨床資料的原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本存檔蠟塊40例(喉癌組)，其中10例保留有相鄰的安全緣以外的正常喉黏膜組織(對照組)。40例患者中，男31例，女9例，年齡43－76歲，平均(57.6 ±6.2)歲。按國際抗癌聯(lián)合會(UICC)2002年TNM分期方案進(jìn)行分期，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期12例，Ⅲ期5例，Ⅳ期4例;聲門上型癌24例，聲門型11例，聲門下型5例;高分化鱗癌28例，中分化鱗癌9例，低分化鱗癌3例;經(jīng)病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。所有病例術(shù)前均未行放、化療，病理診斷均為喉鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 試劑與方法 Omi/HtrA2羊抗人單克隆抗體購自Santa-Cruz公司，caspase-7鼠抗人單克隆抗體購自Lab Vision公司，二步法免疫組化檢測試劑盒PV-6000購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本均經(jīng)中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做4 μm厚連續(xù)切片備用。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)二步法檢測Omi/HtrA2和caspase-7表達(dá)，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判斷 Omi/HtrA2、caspase-7蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。陰性對照以PBS液代替一抗，陽性對照為已知陽性切片。所有切片采用雙盲法閱片，隨機(jī)觀察10個100倍視野并計數(shù)，每個視野至少計數(shù)100個細(xì)胞，取其平均值作為該病例的細(xì)胞陽性數(shù)，并據(jù)此對染色結(jié)果分級，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為陰性(－)，陽性細(xì)胞數(shù)25%－50%為陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為強(qiáng)陽性(++)。采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)(四川川大智勝公司)對染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，在100倍視野下每例標(biāo)本選取5個陽性顆粒清晰，無非特異染色的視野，測定其目標(biāo)平均灰度(G0)，視場平均灰度(GV)，面積密度(area ratio，AAR，即目標(biāo)面積與視場面積的比值)按以下公式計算陽性單位(positive unit，PU)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 Omi/HtrA2和caspase-7的表達(dá) Omi/HtrA2、caspase-7陽性表達(dá)均主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。Omi/HtrA2在喉鱗癌組織和正常喉黏膜組織中表達(dá)(圖1)的陽性率分別為:72.5%(29/40)和20.0%(2/10)，平均陽性單位分別為 26.952±7.145 和10.395 ±6.978，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.715，P＜0.05)。caspase-7 在喉鱗癌組織和正常喉黏膜組織中表達(dá)(圖2)的陽性率分別為:67.5%(27/40)、30.0%(3/10)，平均陽性單位分別為 29.365 ±8.152和 9.362 ±4.234，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.891，P＜0.05)。喉鱗癌組織中Omi/HtrA2和caspase-7表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.332，P＜0.05)。

圖1 喉癌組織中Omi/HtrA2蛋白表達(dá)(DAB，×400)Fig 1 Expression of Omi/HtrA2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma(DAB，×400)

圖2 喉癌組織中caspase-7蛋白表達(dá)(DAB，×400)Fig 2 Expression of Omi/HtrA2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma(DAB，×400)

2.2 Omi/HtrA2和caspase-7表達(dá)與喉鱗癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系 喉鱗癌組織中Omi/HtrA2和caspase-7表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期有無淋巴轉(zhuǎn)移無相關(guān);與癌組織病理學(xué)分級有關(guān)，見表1。

3 討論

Omi/HtrA2是一種重要的促凋亡蛋白，是一種寡聚絲氨酸蛋白酶，由458個氨基酸組成，分子量為51 kD，編碼基因位于染色體2q13(或2p12)。Omi/HtrA2作為新近發(fā)現(xiàn)的促凋亡因子，對多種腫瘤細(xì)胞具有促凋亡效應(yīng)［1，2］。Omi/HtrA2 以三聚體的形式存在，Omi/HtrA2分子結(jié)構(gòu)中含有氨基末端的Reaper樣基序，絲氨酸蛋白酶功能區(qū)和C末端的PDZ結(jié)構(gòu)域，此外，Omi/HtrA2還具有一個胰蛋白酶樣催化結(jié)構(gòu)域和線粒體定向序列［3－5］。Omi/HtrA2通過兩種方式促進(jìn)凋亡的發(fā)生:①結(jié)合X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)，通過caspase依賴的方式促凋亡;②憑借其絲氨酸蛋白酶活性以多條途徑促凋亡。近來的研究發(fā)現(xiàn)Omi/HtrA2在胃癌和卵巢癌中高表達(dá)［6，7］，本研究發(fā)現(xiàn) Omi/HtrA2 在喉鱗癌組織中高表達(dá)，在正常黏膜組織中弱表達(dá)，二者表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Omi/HtrA2在喉癌的發(fā)生、發(fā)展中起著一定作用。本研究中，在喉癌不同病理分級中，G1與G2+G3級比較，Omi/HtrA2表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示Omi/HtrA2過表達(dá)與喉癌的惡性程度有關(guān)，Omi/HtrA2可能參與了腫瘤的分化，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究還顯示，Omi/HtrA2陽性表達(dá)與喉癌患者的年齡、性別、臨床分型(腫瘤部位)、臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，提示Omi/HtrA2過表達(dá)只是喉癌發(fā)生、發(fā)展過程中一個較早期的重要分子事件。

caspase-7屬于半胱氨酸－天冬氨酸蛋白酶家族成員，是 caspase家族中重要成員，caspase-7是caspase級聯(lián)反應(yīng)中的下游分子之一，由303個氨基酸組成，分子量為35 kD，分布在胞質(zhì)內(nèi)和近膜結(jié)構(gòu)上，是凋亡的最終效應(yīng)分子之一。在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中，目前發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有三條:一為caspase的細(xì)胞外通路(細(xì)胞膜途徑);二為caspase的細(xì)胞內(nèi)通路(線粒體途徑);三為caspase的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。caspase-7是重要的效應(yīng)蛋白，在三條凋亡途徑中都起作用。本研究發(fā)現(xiàn)caspase-7在喉鱗癌組織中高表達(dá)，在正常黏膜組織中弱表達(dá)，二者表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明caspase-7可能與喉癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。caspase-7在喉癌中的表達(dá)與喉癌患者的年齡、性別、臨床分型(腫瘤部位)、臨床TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，僅與組織分化有關(guān)，提示caspase-7可能通過調(diào)控喉癌細(xì)胞的凋亡影響喉癌的惡性程度。

表1 Omi/HtrA2和caspase-7表達(dá)與喉鱗癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between expression of Omi/HtrA2，caspase-7 and clinical pathological features in larynx cancer tissues

本研究對Omi/HtrA2和caspase-7在喉鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者存在相關(guān)性，提示Omi/HtrA2可能通過多種作用方式裂解XIAP，從而解除了 XIAP對caspase-7的抑制作用，引起caspase-7在喉鱗癌組織中高表達(dá)。喉鱗癌組織中凋亡機(jī)制非常復(fù)雜，細(xì)胞凋亡減少是各種促凋亡因素和抑制凋亡因素共同作用的結(jié)果，也是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，這也提示我們利用各種方法促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡可以達(dá)到治療腫瘤的目的，利用Omi/HtrA2抑制凋亡抑制蛋白(IAPs)的作用來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡可為惡性腫瘤的治療提供新思路。

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