嚴 鳳，顧 欣，李丹妮，張文剛，蔣 音，張 鑫

(上海獸藥飼料檢測所，上海 201103)

頭孢噻呋(Ceftiofur)是美國普強公司于20世紀80年代開發(fā)成功的獸醫(yī)專用第三代頭孢菌素類藥物，其抗菌譜廣，抗菌活性強，對革蘭氏陽性菌、陰性菌及一些厭氧菌都有很強的抗菌活性，用于肉牛、奶牛、馬、豬、羊的呼吸道疾病治療［1-2］。隨著頭孢噻呋在畜牧業(yè)中的廣泛使用，不可避免地引起其在動物組織或其產(chǎn)品中的殘留。歐盟2002年4月頒布了關于頭孢噻呋在組織中的最大殘留量(MRL)，在牛奶中的 MRL 為100 μg/kg［3］。頭孢噻呋只被批準注射用，然而，頭孢噻呋偶爾會被用于乳房內(nèi)注入治療牛大腸菌群乳腺炎，這種用法會導致殘留超出限量，并已導致數(shù)起牛奶殘留超標［4］。頭孢噻呋作為乳房內(nèi)注入劑使用，還沒有相應的殘留數(shù)據(jù)來制定合適的休藥期(也稱棄奶期)推薦給執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師。因此，本實驗通過對泌乳期奶牛乳房內(nèi)灌注頭孢噻呋藥物，對其在牛奶中消除動力學進行初步研究，為制定休藥期給予參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 頭孢噻呋鈉，注射液規(guī)格1.0 g(以頭孢噻呋計)，批號091001，河北遠征制藥有限公司。

1.1.2 實驗動物 3頭健康荷斯坦奶牛。飼養(yǎng)記錄分析顯示奶牛在當前泌乳期內(nèi)沒有使用抗菌藥物治療過。在試驗期間，奶牛正常飼養(yǎng)。

1.1.3 標準品與試劑 頭孢噻呋標準品(純度99%，Sigma公司)，二硫赤蘚糖醇(純度 99%，Sigma公司)，碘乙酰胺(純度 98%，Sigma公司)。乙腈為色譜純(Merck)，其他試劑為分析純，水由MilliQ凈化系統(tǒng)(Millipore公司)制得。頭孢噻呋儲備液(1 mg/mL):稱取10 mg頭孢噻呋標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20℃保存，有效期為6個月。0.05 mol/L硼酸緩沖液:稱取19 g硼酸和3.7 g氯化鉀溶于900 mL水中，調(diào)節(jié)pH至9.0，用水定容到1 L。0.025 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0):將3.5 g磷酸二氫鈉溶于 900 mL 水中，調(diào)節(jié)pH值至 7.0，用水定容至1 L。0.4%DTE 提取液(W/V):稱取1.0 g二硫赤蘚糖醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。14%碘乙酰胺溶液(W/V):稱取7.0 g碘乙酰胺，溶于 50 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。25%磷酸溶液:取25 mL磷酸，加水溶解并稀釋至100 mL。

1.1.4 儀器與設備 超高效液相色譜儀(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)，Waters公司;串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(Quattro Premier XE)，Waters公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Laboroto 4000)，德國Heidolph公司;Oasis HLB(60 mg/3 cc)，Waters公司。

1.2 試驗方法 每頭奶牛有一個乳區(qū)不注入頭孢噻呋鈉，為空白對照乳區(qū)，其余三個為用藥區(qū)。在試驗正式開始前，收集基礎(空白)牛奶樣品，每個乳房用藥量為0.3 g(以頭孢噻呋計)，注入每頭奶牛的乳房。大約8 h后，再次注入0.3 g(以頭孢噻呋計)至奶牛的乳房。每8 h(在泌乳時)從每頭牛的4個乳腺收集初乳樣品(50 mL)，共6 d。牛奶樣品收集后立即冰凍，在-20℃保存至分析。研究結(jié)束后，奶牛按計劃結(jié)束產(chǎn)奶，或從牛群中淘汰。此研究中任何奶牛在當前用藥期間內(nèi)所產(chǎn)牛奶不得銷售。

1.3 頭孢噻呋及其代謝物的檢測方法

1.3.1 提取與衍生 取1.0 mL牛奶于50 mL離心管中，加入11 mL 0.4%DTE提取液，混勻，于50℃恒溫箱中保溫15 min。加入3 mL 14%碘乙酰胺溶液，搖勻，室溫下靜置衍生30 min。用25%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至2.5～2.6，離心15 min(4℃，10 000 r/min)。

1.3.2 凈化 依次用10 mL甲醇、10 mL水活化HLB萃取柱，取5 mL上清液過柱，流速為1 mL/min，用4 mL水淋洗小柱之后，用5 mL 90%乙腈溶液洗脫，洗脫液于60℃旋轉(zhuǎn)蒸干，殘余物用1 mL 0.2%的甲酸溶液復溶，過 0.22 μm 濾膜，供測定。

1.3.3 LC-MS/MS分析 色譜條件:色譜柱為Waters BEH C18，100 mm × 2.1mm(I.D.)，1.7 μm，柱溫40℃;流動相為乙腈 -水(12∶88)，流速0.2 mL/min，進樣量 10 μL。質(zhì)譜條件:采用 ESI正離子多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓3.00 kV;錐孔電壓25 V;離子源溫度120℃;脫溶劑溫度380℃;脫溶劑氣流速700 L/h。定性離子對 m/z 487.0＞241.0的碰撞能量為15 eV;定量離子對m/z 487.0＞210.0的碰撞能量為20 eV。

2 結(jié)果

2.1 方法學 在添加濃度10～500 ng/mL范圍內(nèi)，峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x)呈良好的線性關系，其線性方程為y=11.29x-36.20，相關系數(shù) r=0.9990，r2=0.9980。檢測限 (LOD)和定量限(LOQ)分別為4 ng/mL和10 ng/mL，低于牛奶中頭孢噻呋的殘留限量。牛奶中添加10、50、500 ng/mL三個濃度，加標平均回收率為97.42% ～108.78%。

圖1 3頭泌乳期奶牛的3個乳腺區(qū)進行頭孢噻呋乳內(nèi)注入用藥后(300 mg，間隔8 h，2次用藥)牛奶中頭孢噻呋消除的平均值

2.2 消除動力學 乳房內(nèi)給予頭孢噻呋藥物，最初可引起牛奶中頭孢噻呋的高濃度 107.89 μg/mL，牛奶中藥物達峰時間為8 h。在乳房內(nèi)用藥后的最初56 h內(nèi)，頭孢噻呋濃度快速下降(圖1)。當濃度下降到約0.2 μg/mL以下時(大約在最后一次用藥后的64h)，頭孢噻呋的消除速度開始緩慢。最后一次給藥88 h后，所有乳腺中頭孢噻呋的濃度都低于允許限量(0.1 μg/mL)(表1)，最后一次給藥120 h后所有牛奶樣品中頭孢噻呋濃度都低于定量限。

表1 對3頭泌乳期奶牛3個乳腺進行頭孢噻呋鈉乳內(nèi)注入用藥(300 mg，間隔8 h，2次用藥)后頭孢噻呋濃度超出允許限量(0.1μg/mL)的牛奶樣品數(shù)

3 討論

用藥后，頭孢噻呋快速代謝為脫呋喃甲酸頭孢噻呋(desfuroyleceftiofur，DFC)和呋喃甲酸(furoic acid)。DFC進一步代謝為二硫化物類，如去呋喃甲酰頭孢噻呋半胱氨酸二硫化物。游離的DFC含有一個完整的β-內(nèi)酰胺環(huán)，它是具有微生物學生理活性的頭孢噻呋代謝物。因此，檢測牛奶中頭孢噻呋殘留的分析，也要能檢測DFC和它的其他二硫化物代謝物。本文所用的UPLC-MS/MS方法，頭孢噻呋和其他所有含完整β-內(nèi)酰胺環(huán)的代謝產(chǎn)物通過使用二硫赤蘚糖醇先轉(zhuǎn)化為DFC。在還原狀態(tài)下，溶液中過量的二硫赤蘚糖醇維持著DFC上的巰基基團，同時與碘乙酰胺反應生成乙酰胺脫呋喃甲酸頭孢噻呋(desfuroyleceftiofur-acetamide，DCA)。這樣，單次的UPLC-MS/MS分析就能同時檢測奶牛的生鮮牛乳中頭孢噻呋及多種代謝物。

盡管牛奶中頭孢噻呋濃度相當迅速地下降，但在最后一次給予頭孢噻呋藥物后，需要88 h(3.66 d)才能使所有牛奶樣品中頭孢噻呋濃度低于允許限量。研究中有3頭奶牛三個乳腺的牛奶中頭孢噻呋殘留濃度低于允許限量，都需要80 h(3.33 d)至88 h(3.66 d)。研究結(jié)果表明，頭孢噻呋乳內(nèi)注入藥物治療乳牛的乳腺炎，可引起抗菌藥物殘留超出FDA對頭孢噻呋的允許限量。基于上述研究結(jié)果初步建議，頭孢噻呋在牛奶中的休藥期(棄奶期)為4 d。

［1］Matthias Becker，Erhard Zittlau，Michael Petz.Quantitative Determination of Ceftiofur-related Residues in Bovine Raw Milk by LC-MS/MS with Electrospray Ionization［J］.Eur Food Res Technol，2003，(217):449-456.

［2］丁煥中，陳杖榴.獸用抗生素頭孢噻呋的研究進展［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2000，(4):17-21.

［3］郝智慧，劉 力，馮淇輝.動物性食品中頭孢噻呋殘留檢測研究［J］.藥物檢測，2004，21(4):26-27.

［4］Geof W Smith，Ronette Gehring，Jim E Riviere，et al.Elimination Kinetics of Ceftiofur Hydrochloride after Intramammary Administration in Lactating Dairy Cows［J］.Journal of the American Veterinary Medical Association，2004，224(11):1827-1830.