劉正才，楊 方，余孔捷，張 瓊，林永輝，陳瑞清

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局，福州 350001;2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福州 350003)

氯霉素類(lèi)和硝基呋喃類(lèi)藥物是水產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖中常用的廣譜抗菌藥物，臨床上使用的主要有氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮等藥物。由于這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)殘留的原藥或代謝產(chǎn)物會(huì)給人類(lèi)健康造成一定的毒性，世界上絕大部分國(guó)家(包括歐盟、美國(guó)、日本等)規(guī)定在動(dòng)物食用組織中不允許有氯霉素和硝基呋喃類(lèi)藥物殘留，我國(guó)在農(nóng)業(yè)部193號(hào)公告中把氯霉素和硝基呋喃類(lèi)列為養(yǎng)殖禁用物質(zhì)［1］。然而，一些不法獸藥生產(chǎn)企業(yè)受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，在允許使用的獸藥制劑中非法添加禁用化學(xué)藥物，由于這種添加往往是隱形的，雖然可能增強(qiáng)藥效，但存在藥物殘留的隱患，所以對(duì)此類(lèi)藥物的檢測(cè)勢(shì)在必行。目前測(cè)定氯霉素類(lèi)和硝基呋喃類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)和方法很多［2-7］，這些標(biāo)準(zhǔn)所適應(yīng)的范圍包括動(dòng)物源性食品、飼料(預(yù)混合飼料)、蜂產(chǎn)品、腸衣等。對(duì)硝基呋喃類(lèi)藥物，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)均為檢測(cè)其殘留代謝物標(biāo)示物，而對(duì)于獸藥的檢測(cè)，由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)動(dòng)物基體的吸收，因此只需檢測(cè)其母體原藥。目前很少有適應(yīng)于獸藥制劑中氯霉素類(lèi)和硝基呋喃類(lèi)原藥等獸藥測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法。由于獸藥制劑成分復(fù)雜，提取和分離困難，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，常規(guī)的飼料、動(dòng)物組織中的化學(xué)藥物分析方法難于直接用于獸藥制劑的分析，所以建立一套有效的分析方法是非常必要的。本方法在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［8-9］，建立了獸藥制劑中三種氯霉素類(lèi)藥物(氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)和四種硝基呋喃類(lèi)原藥(呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定性檢測(cè)方法。該方法靈敏度高、效果好，可滿足市場(chǎng)上常規(guī)獸藥粉劑中氯霉素類(lèi)和硝基呋喃類(lèi)藥物定性篩查需求。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 標(biāo)準(zhǔn)品呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素純度≥99.0%，購(gòu)自Sigma公司;乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自北京振翔公司;乙酸乙酯為分析純，購(gòu)自上海試劑一廠;實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 6682一級(jí)水的要求。

1.2 儀器 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源，4000 Q Trap，美國(guó)Applied Biosystems公司;渦旋混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠;離心機(jī)，ANKE TDL-5，上海安亭科學(xué)儀器廠;MilliQ純水系統(tǒng)，Millipore公司;Oasis HLB固相萃取小柱(3 cc/60 mg)，Waters公司。

1.3 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別稱取硝基呋喃類(lèi)、氯霉素類(lèi)各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(準(zhǔn)確至0.01 mg)，分別用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，溶液濃度為100.0 μg/mL，4 ℃以下保存，保存期為6個(gè)月。混合工作液:分別取7種硝基呋喃類(lèi)、氯霉素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL容量瓶中，置4℃以下保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱:Luna 3μ C18(2)150 mm ×3.0 mm(Phenomen公司);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量 10 μL;流速 0.3 mL/min;流動(dòng)相 A:水，流動(dòng)相B:乙腈，按梯度程序(表1)進(jìn)行分析。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正負(fù)離子切換模式;采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，電噴霧電壓(IS):5 000 V;氣簾氣壓力(CUR):0.172 MPa(氮?dú)?;離子源溫度(TEM):550℃;霧化氣壓力0.379 MPa;輔助氣壓力0.379 MPa;其他質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 被測(cè)物的簡(jiǎn)寫(xiě)、電離模式、母離子、子離子以及碰撞電壓等參數(shù)

1.5 樣品處理 稱取1 g(精確到0.01 g)樣品于100 mL容量瓶中，加入約50 mL水充分溶解，再用甲醇-水(50∶50，V/V)混合溶液準(zhǔn)確定容至刻度，充分混勻后靜止5 min。分取10 mL溶解液，用10 mL乙酸乙酯提取兩次，合并乙酸乙酯，于40℃避光旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加10 mL水，搖勻后過(guò)HLB固相萃取柱，10 mL水淋洗后，減壓抽干5 min。用5 mL甲醇洗脫，有機(jī)相在40℃以下避光氮吹至近干，用乙腈-水(1∶9，V/V)溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?.0 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇 由于待測(cè)的化合物性質(zhì)差別較大，在質(zhì)譜上電離方式差異較大，氯霉素類(lèi)、呋喃西林和呋喃妥因采用ESI(-)獲得很好的響應(yīng)值，而呋喃唑酮和呋喃它酮ESI(+)獲得很好的響應(yīng)值，因此采用乙腈與水作為流動(dòng)相，其洗脫梯度如表1所示，所測(cè)化合物在10 min內(nèi)獲得較好的分離。

2.2 提取與凈化方式的選擇 獸藥粉劑基體比較復(fù)雜，含有大量的鹽和乳化劑，樣品溶解后直接用水稀釋過(guò)HLB固相萃取小柱回收率低，基體質(zhì)譜抑制大。本實(shí)驗(yàn)先用有機(jī)溶劑(乙酸乙酯)提取，避免了樣品中有機(jī)鹽分的干擾，獲得了較好的過(guò)柱回收率(表3)。

表3 各種抗菌藥物在復(fù)方氨芐西林粉中的回收率比較(n=6)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限 以各組分定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y軸)，質(zhì)量濃度(x軸，ng/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)(r)如表4所示。選擇不含待測(cè)化合物的樣品，按照上述的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，得到空白基質(zhì)溶液，以此溶液稀釋各標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣，得到各抗菌藥物的基質(zhì)質(zhì)譜圖，按照3倍信噪比(S/N)計(jì)算所對(duì)應(yīng)化合物的濃度為檢測(cè)限，其結(jié)果如表4所示。從表中可以看出，每種化合物的檢測(cè)限均小于0.5 mg/kg，因此利用該方法可比較滿意地檢測(cè)到獸藥粉劑中添加的微量抗菌藥物。

表4 7種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及檢測(cè)限

2.4 定性判斷 由于所分析的獸藥制劑成分復(fù)雜，對(duì)每個(gè)樣品的基體性質(zhì)差別較大，而且對(duì)所分析化合物的濃度含量低，定量結(jié)果的變異系數(shù)較大，因此此方法可作為定性篩選分析，判斷依據(jù)分別參考保留時(shí)間定性的原理以及歐盟委員會(huì)第2002/657/EC號(hào)決議《歐盟委員會(huì)關(guān)于分析方法評(píng)價(jià)和結(jié)果解釋的決定》中關(guān)于串聯(lián)質(zhì)譜殘留分析4個(gè)識(shí)別點(diǎn)要求和豐度比的定性確證的要求［9］(表5)。

在上述操作條件下，用流動(dòng)相平衡系統(tǒng)平衡，待儀器穩(wěn)定后，注入標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣品溶液以及加標(biāo)樣液，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜MRM掃描模式進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)各化合物標(biāo)樣的保留時(shí)間和主要碎片離子豐度比進(jìn)行定性。僅在完全同時(shí)滿足以下3個(gè)條件時(shí)，才判斷為陽(yáng)性:(1)未知物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間相差不超過(guò)0.2 min;(2)未知物兩個(gè)子離子響應(yīng)信號(hào)的信噪比均大于3;(3)如果檢出的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品一致，并且在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的同樣條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，誤差不超過(guò)表5中規(guī)定的范圍。

表5 被測(cè)物的保留時(shí)間以及定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許誤差

2.5 檢測(cè)限和專屬性方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 參考美國(guó)FDA分析方法驗(yàn)證指南中關(guān)于各類(lèi)檢測(cè)的推薦驗(yàn)證項(xiàng)目要求［8］，本方法主要驗(yàn)證的內(nèi)容為檢測(cè)限和專屬性。稱取不同的陰性樣品，考慮到非法添加的程度不一樣，按微量、衡量添加水平估算，分別為1.0、2.0、100.0 倍檢測(cè)限(LOD)的標(biāo)準(zhǔn)液，按以上操作步驟進(jìn)行測(cè)試(圖1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果參照文獻(xiàn)定性方法以檢出概率表示，檢出概率(POD，Probability of detection)［10］:對(duì)于給定基體與特定分析物水平或濃度來(lái)說(shuō)，是檢出陽(yáng)性分析結(jié)果在所有檢測(cè)結(jié)果中所占比例。公式為:POD=，其中x為檢出陽(yáng)性結(jié)果次數(shù)，N為測(cè)定總次數(shù)，結(jié)果如表6所示。同時(shí)還對(duì)陰性樣品“復(fù)方氨芐西林粉”(主成分氨芐西林)、“鐵桿無(wú)敵”(主成分林可霉素)、“腸毒清”(主成分林可霉素)進(jìn)行了同樣的測(cè)試，結(jié)果表明，在1.0、2.0、100.0 倍 LOD 水平上都有檢出，表明此方法專屬性良好，靈敏度較高，可滿足獸藥制劑中對(duì)氯霉素類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)物質(zhì)定性篩選的要求。

表6 添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=20，基體為硫酸粘桿菌素預(yù)混劑)

圖1 在檢測(cè)限水平上的加標(biāo)樣品色譜圖(基體為硫酸粘桿菌素預(yù)混劑)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定 采用此方法對(duì)市售常用獸藥200個(gè)批次進(jìn)行檢測(cè)，監(jiān)測(cè)的獸藥商品名有硫酸安普霉素可溶性粉、三和新和奇、氨芐青霉素鈉可溶性粉、鹽酸多西環(huán)素、阿奇霉素可溶性粉、菌痢王、炎迪、癸氧喹酯預(yù)混劑等非主要檢測(cè)成分的獸藥，其中1個(gè)批次檢出氯霉素，18個(gè)批次檢出氟甲砜霉素。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時(shí)快速分析和監(jiān)測(cè)7種獸藥制劑中氯霉素類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)化合物，該方法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為企業(yè)更好控制在用藥物提供了一定參考，為管理部門(mén)監(jiān)控禁用物質(zhì)的非法添加提供檢測(cè)方法參考。

［1］Commission Regulation(EC)No 1442/95.Commission Regulation(EC)No 1442/95 of 26 June 1995 Amending Annexes I，II，III and IV of Council Regulation(EEC)No 2377/90 Laying down a Community Procedure for the Establishment of Maxmum Residue Limits of Veterinary Medicinal Products in Food［S］.

［2］葛寶坤，王云風(fēng)，常春艷.測(cè)定雞肉、水產(chǎn)品中四種硝基呋喃類(lèi)藥物殘留量的固相萃取-液相色譜法［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2003，22(5):91-93.

［3］林黎明，林回春，劉心同.固相萃取高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中硝基呋喃代謝產(chǎn)物［J］.分析化學(xué)，2005，33(5):707-710.

［4］蔣 原，丁 濤.液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)蜂蜜中四種硝基呋喃類(lèi)代謝物［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37(3):12-15.

［5］彭 濤，李淑娟，儲(chǔ)曉剛，等.高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蝦中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留量［J］.分析化學(xué)，2005，33(4):463-466.

［6］陳小霞，岳振峰，吉彩霓，等.高效液相色譜-電噴霧電離三級(jí)四極桿質(zhì)譜測(cè)定雞肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留量［J］.色譜，2005，23(1):92-95.

［7］謝 文，丁慧瑛，黃雷芳，等.高效液相色譜-電噴霧電離三級(jí)四極桿質(zhì)譜檢測(cè)動(dòng)物源食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考?xì)埩袅浚跩］.分析試驗(yàn)室，2007，25:1-4.

［8］Feldsine P，Abeyta C，Andrews W H.AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis［J］.J AOAC Int，2002，85(5):1187-1200.

［9］Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Result(Official Journal L221，17 August 2002，pp.:8-36).

［10］ ISO 16140.Microbiology of Food and Animal Feeding Staffs-Protocol for the Validation of Alternative Methods［S］.