劉雅妮，商 軍，郭士博

(1.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由質(zhì)粒編碼的，能通過結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)形式，造成耐藥基因在細(xì)菌間擴(kuò)散，使敏感菌變成耐藥菌;且產(chǎn)生ESBLs菌耐藥譜廣，表現(xiàn)為多重耐藥，是臨床常見的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要耐藥機(jī)制［1-2］。隨著獸醫(yī)臨床上抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，大腸埃希菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，甚至對多種抗菌藥物同時耐藥的多重耐藥菌株也屢見不鮮，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和耐藥細(xì)菌的感染常使經(jīng)驗性治療難以奏效，給獸醫(yī)臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)。近年來，由于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)造成部分β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物臨床失效的情況日益嚴(yán)重，對動物和人類的健康造成嚴(yán)重威脅，而大腸埃希菌是表示抗菌藥物耐藥性水平的一種指示菌［3-5］，因此有必要對大腸埃希菌的耐藥性和ESBLs基因進(jìn)行分析和研究。為了解大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢出率及其耐藥性，指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理用藥，對2010年9月-2011年3月從上海地區(qū)10個規(guī)?；B(yǎng)豬場分離得到的296株大腸埃希菌進(jìn)行了研究分析。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株，大腸埃希菌，2010年9月-2011年3月從上海地區(qū)10個規(guī)?；B(yǎng)豬場肛門樣本中分離得到;質(zhì)控菌株，大腸埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603，美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心;7000熒光PCR擴(kuò)增儀，美國AB公司;Taqman Mix PCR反應(yīng)液、引物和探針，上海英駿公司;低溫離心機(jī)，德國Beckman公司;VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)及配套細(xì)菌鑒定卡(GN卡)，法國生物梅里埃公司;普通營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;麥康凱瓊脂，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 采樣 以滅菌棉簽拭子采豬肛門作為大腸埃希菌分離，每個養(yǎng)殖場采30～60份拭子樣本，共320份樣本。

1.2.2 菌株分離、純化與鑒定 取拭子樣品用接種棒直接接種于麥康凱瓊脂平面，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取粉紅色、邊緣光滑的大腸埃希菌可疑菌落，用麥康凱培養(yǎng)基純化一代，然后接種于營養(yǎng)瓊脂平面，37℃培養(yǎng)12～24 h。采用生物梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定出296株，分離率為92.5%。

1.2.3 ESBLs確證試驗 采用微量肉湯稀釋法，用頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟三種抗生素進(jìn)行初篩試驗。以頭孢他啶、頭孢他啶+克拉維酸和頭孢噻肟、頭孢噻肟+克拉維酸這兩種組合進(jìn)行確證試驗。結(jié)果判讀參照美國全國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI M100-S20)推薦的ESBLs表型確證試驗法篩選出產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌52株［6］。

1.2.4 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法，對52株產(chǎn)ESBLs和244株非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行5類10種常見獸用抗菌藥物藥敏試驗。按農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《抗菌藥敏感性試驗操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)》和CLSI M100-S20標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果［6］。

1.2.5 實時熒光PCR擴(kuò)增 (1)引物設(shè)計。分別根據(jù)ESBLs的SHV、TEM、CTX-M、OXA編碼基因序列設(shè)計引物和探針，所有引物由上海英駿合成(表1);(2)菌液的DNA模板制備。采用傳統(tǒng)的煮沸法提取質(zhì)粒DNA［7］，挑取新鮮單個菌落溶于100 μL 雙蒸水，煮沸 15 min，10000 r/min，離心 5 min，吸取上清液作為模板液備用;(3)陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株制備。將定性PCR擴(kuò)增出的SHV、TEM、CTX-M、OXA全長序列產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，DH5α大腸埃希菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化;(4)PCR反應(yīng)體系。Platinum Super Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，終濃度為 0.4 μmol/L，Taq Man 探 針 0.3 μL，終 濃 度 為0.24 μmol/L，模板1 μL，雙蒸水補至25 μL;(5)PCR 反應(yīng)參數(shù)。試驗采用兩步法進(jìn)行。50℃，2 min，激活UNG酶;94℃預(yù)變性2 min，激活金牌Taq Man酶，94℃變性30 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)，所有檢測熒光擴(kuò)增曲線由7000檢測系統(tǒng)自動生成;(6)擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測序。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，克隆測序，并與NCBI基因庫進(jìn)行序列比較。

表1 ESBLs四種基因型熒光PCR引物和探針的設(shè)計

2 結(jié)果

2.1 ESBLs的篩選和藥敏試驗結(jié)果 按1.2.3 ESBLs確證試驗，采用微量肉湯稀釋法，從296株大腸埃希菌中篩選出52株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，分離率為17.6%。按1.2.4藥敏試驗，對52株產(chǎn)ESBLs和244株非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行10種抗菌藥物的藥敏試驗，試驗結(jié)果如表2、圖1所示。試驗結(jié)果表明，產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌，且產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌組表現(xiàn)為多重耐藥性。耐藥率在90%以上的有氨芐西林、頭孢唑啉和諾氟沙星;70%以上的為復(fù)方新諾明和氟苯尼考;60%以上的為頭孢噻呋和卡那霉素;50%以上的為奧格門丁(阿莫西林/克拉維酸)、慶大霉素和達(dá)氟沙星。對10種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的多重耐藥性，主要為7重～10重耐藥。值得關(guān)注的是，對頭孢噻呋和諾氟沙星耐藥率，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌顯著性地高于非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。

表2 52株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和244株非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥敏試驗比較結(jié)果

圖1 52株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和244株非產(chǎn)ESBLs

2.2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型檢測結(jié)果 按1.2.5實時熒光PCR擴(kuò)增，通過設(shè)計四對特異性引物和探針對每株細(xì)菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，對確證的52株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行基因分型試驗，結(jié)果如表3、圖2所示。試驗結(jié)果表明，52株細(xì)菌中46株攜帶TEM型的基因，占總數(shù)的88.5%;15株細(xì)菌攜帶CTX-M型基因，占總數(shù)的28.8%;11株細(xì)菌同時攜帶TEM型和CTX-M型基因，占總數(shù)的21.2%;未檢出攜帶 SHV型、OXA型的菌株;2株未檢測到上述四種基因型，可能還存在其他基因型，有待于進(jìn)一步的研究。

表3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果

圖2 TEM基因型和CTX-M基因型ESBLs的PCR反應(yīng)曲線

3 討論

在分離的296株豬源大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs檢出率為17.6%，對10種抗菌藥物藥敏試驗中，與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌相比，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對頭孢唑啉、頭孢噻呋、慶大霉素、諾氟沙星和達(dá)氟沙星呈現(xiàn)更高的耐藥性，對動物專用藥物第三代頭孢菌素頭孢噻呋的耐藥率為63.5%，且對10種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的多重耐藥性，主要為7重～10重耐藥，占88.5%。

在對52株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型分析中，檢出攜帶TEM型、CTX-M型和TEM+CTX-M型ESBLs耐藥基因，沒有檢出攜帶SHV型、OXA型和TEM型+SHV型ESBLs耐藥基因，提示這可能與上海地區(qū)規(guī)?；i場使用頭孢菌素類藥物的種類和頻率有關(guān)，且規(guī)模化豬場產(chǎn)生ESBLs的大腸埃希氏菌未通過質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌間耐藥基因的交換。

由于抗生素選擇性壓力的不斷增大，人醫(yī)臨床新的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶不斷涌現(xiàn)［8-9］，抑制細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性是克服該類細(xì)菌耐藥性的有效手段。為防止產(chǎn)ESBLs菌的克隆性傳播，畜禽養(yǎng)殖場應(yīng)制定有效的消毒隔離措施，并結(jié)合藥敏結(jié)果，合理應(yīng)用抗生素，尤其是第三代頭孢菌素，延緩耐藥菌株的產(chǎn)生，輪換使用抗生素，對控制產(chǎn)ESBLs菌株的感染將起到十分重要的作用。

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